抗酸染色全自動顯微掃描識別系統(tǒng)的臨床應(yīng)用評價

丁北川 周復(fù) 楊新宇 孟憲杰 易俊莉 葉健苗 武文清

抗酸染色顯微鏡檢因易于推廣并實施，且具有較高的效益成本比，廣泛用于結(jié)核病病原學檢查。然而，傳統(tǒng)的抗酸染色顯微鏡檢結(jié)果在各實驗室間及專業(yè)技術(shù)人員間差異較大[1]。隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外利用機器視覺在細胞自動識別和圖像分析方面開展了大量的研究，可對細胞進行自動識別和自動篩選的細胞檢測和圖像分析設(shè)備相繼推出[2-3]。在分枝桿菌抗酸染色檢測方面的相應(yīng)設(shè)備主要包括兩個系統(tǒng)：一是實現(xiàn)涂片視野掃描自動調(diào)焦顯微放大獲取圖像的平臺系統(tǒng)；另一部分是通過判讀軟件實現(xiàn)抗酸染色顯微圖像自動識別[4]。筆者選取肺結(jié)核患者的痰液標本，應(yīng)用抗酸染色全自動顯微掃描系統(tǒng)(AFB-AS)進行檢測，以了解其應(yīng)用效果。

對象和方法

一、 研究對象

搜集2019年1月至8月于北京結(jié)核病控制研究所確診的462例肺結(jié)核患者作為研究對象，每例患者留取3份初診痰液標本，共計1386份，均進行抗酸染色。每例患者選取2份痰液標本進行分枝桿菌分離培養(yǎng)，共計完成924份；其中1份同時進行GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)檢測，共計完成462份。

二、 實驗方法

(一)抗酸染色

參照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]，完成玻片制備和萋-尼抗酸染色操作。

1.傳統(tǒng)抗酸染色檢查：使用油鏡(100×；顯微鏡型號：OLYMPUS CX41) 閱片。陰性結(jié)果及陽性結(jié)果分級標準如下：(1)抗酸桿菌陰性：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。(2)抗酸桿菌陽性：①抗酸桿菌菌數(shù)為1～8條/300個視野；②抗酸桿菌陽性(1+)：3～9條/100個視野，連續(xù)觀察300個視野；③抗酸桿菌陽性(2+)：1～9條/10個視野，連續(xù)觀察100個視野；④抗酸桿菌陽性(3+)：每個視野1～9條；⑤抗酸桿菌陽性(4+)：每個視野≥10條。

2.AFB-AS：依照系統(tǒng)使用說明(杭州上池科技有限公司提供，型號：MSS-TB-04)，按照傳統(tǒng)抗酸染色鏡檢和結(jié)果報告模式，每張待檢玻片設(shè)定300個連續(xù)視野進行掃描。記錄下列數(shù)據(jù)：(1)不經(jīng)技術(shù)人員復(fù)核，顯微圖像經(jīng)系統(tǒng)軟件自動判定為陰性或陽性；(2)技術(shù)人員通過觀察顯微圖像的方式，對系統(tǒng)軟件提示“陽性”的圖像進行復(fù)核后判讀結(jié)果。

3.質(zhì)量控制：傳統(tǒng)抗酸桿菌染色檢查報告和AFB-AS檢驗報告由專業(yè)技術(shù)人員采用雙盲法判讀。

(二)培養(yǎng)及核酸檢測

按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[5]，使用羅氏培養(yǎng)基完成痰標本分枝桿菌分離培養(yǎng)。使用Xpert進行結(jié)核分枝桿菌(MTB)核酸檢測。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以“百分率(%)”描述，組間差異的比較采用χ2檢驗，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。以分枝桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果為參照，分析不同方法檢測肺結(jié)核患者痰涂片抗酸桿菌染色的效能，計算公式：敏感度(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值(%)=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值(%)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。方法間一致性檢驗采用Kappa檢驗，Kappa值>0.80認為一致性好，Kappa值為0.61～0.80認為一致性較好，Kappa值為0.41～0.60認為一致性一般，Kappa值<0.41認為一致性較差。各方法檢測肺結(jié)核患者痰涂片抗酸桿菌染色陽性結(jié)果的等級相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性檢驗。

結(jié) 果

一、病原學檢查結(jié)果

以痰標本經(jīng)傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢、AFB-AS檢查、分枝桿菌分離培養(yǎng)或Xpert任一檢測結(jié)果為陽性，判定為病原學陽性，研究對象病原學陽性率為69.91%(323/462)。各檢測方法檢測研究對象病原學陽性率從高到低依次為Xpert(69.26%，320/462)、分枝桿菌分離培養(yǎng)(64.29%，297/462)、AFB-AS(61.04%，282/462)、傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢(58.66%，271/462)，差異無統(tǒng)計學意義(χ2=6.958，P=0.031)。

各方法檢測痰標本陽性率從高到低依次為Xpert(69.26%，320/462)、分枝桿菌分離培養(yǎng)(43.61%，403/924)、AFB-AS(43.22%，599/1386)、傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢(38.24%，530/1386)。AFB-AS檢測痰標本陽性率明顯高于傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=67.015，P<0.01)。

二、不同鏡檢方法比較

1386張抗酸染色玻片經(jīng)傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢和AFB-AS檢查(人工復(fù)核)均報告陰性結(jié)果的玻片有787張，均報告陽性結(jié)果的玻片有530張，一致率為95.02%(1317/1386)；69張玻片(4.98%，69/1386)檢查結(jié)果報告不一致，均為AFB-AS檢查(人工復(fù)核)報告陽性而傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢報告陰性。兩種方法判讀陽性等級相關(guān)系數(shù)(Spearman)為0.954(表1)。

表1 抗酸染色全自動顯微掃描系統(tǒng)(人工復(fù)核)與傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢判讀肺結(jié)核患者痰涂片結(jié)果對比(張)

1386張抗酸染色玻片經(jīng)傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢與AFB-AS檢查(軟件識別)均報告陰性結(jié)果的玻片有683張，均報告陽性結(jié)果的玻片有530張，一致率為87.52%(1213/1386)。173張玻片(12.48%，173/1386)檢查結(jié)果報告不一致，均為AFB-AS檢查(軟件識別)報告陽性而傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢報告陰性。兩種方法判讀陽性等級相關(guān)系數(shù)(Spearman)為0.898(表2)。

表2 抗酸染色全自動顯微掃描系統(tǒng)(軟件識別)與傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢判讀肺結(jié)核患者痰涂片結(jié)果對比(張)

1386張抗酸染色玻片經(jīng)AFB-AS檢查(人工復(fù)核)和AFB-AS檢查(軟件識別)均報告陰性結(jié)果的玻片有683張，均報告陽性結(jié)果的玻片有599張，一致率為92.50%(1282/1386)。104張玻片(7.50%，104/1386)檢查結(jié)果報告不一致，均為AFB-AS軟件識別為陽性，而圖像經(jīng)人工復(fù)核后排除。AFB-AS檢查(人工復(fù)核)和AFB-AS檢查(軟件識別)判讀陽性等級相關(guān)系數(shù)(Spearman)為0.942(表3)。

表3 抗酸染色全自動顯微掃描系統(tǒng)軟件識別與人工復(fù)核判讀肺結(jié)核患者痰涂片結(jié)果對比(張)

三、 各方法檢測效能分析

924份痰標本同時完成分枝桿菌分離培養(yǎng)、傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢和AFB-AS檢查，陽性率分別為43.61%(403/926)、41.47%(384/926)和46.44%(430/926)。培養(yǎng)陽性率明顯高于傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢，低于AFB-AS檢查，差異均有統(tǒng)計學意義(χ2值分別為4.985、9.986，P值均<0.01)。以分枝桿菌分離培養(yǎng)結(jié)果為參照標準，AFB-AS檢查肺結(jié)核患者痰標本敏感度為94.29%，高于傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢的敏感度(89.58%)，見表4。

表4 傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢和抗酸染色全自動顯微掃描系統(tǒng)檢測以培養(yǎng)結(jié)果為參照標準檢測肺結(jié)核患者痰標本的效能

四、 各方法檢測差異分析

462份標本同時完成抗酸桿菌染色、分枝桿菌分離培養(yǎng)和Xpert檢測，其中，23份標本抗酸桿菌染色陽性(包括傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢和AFB-AS)但培養(yǎng)陰性。傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢陽性而培養(yǎng)陰性的標本，經(jīng)Xpert檢測后陽性者占8/9，高于AFB-AS檢查陽性而培養(yǎng)陰性標本的比例(21.43%，3/14)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.991，P<0.01)。

討 論

隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展和高度結(jié)合，已有多個廠家針對抗酸染色檢查推出自動化涂片、自動化染色等設(shè)備。相關(guān)設(shè)備在提高抗酸染色涂片質(zhì)量、縮短檢測周期、提高病原學陽性率、降低人力資源依賴程度、減少生物安全風險等方面，均發(fā)揮一定作用。AFB-AS可以對抗酸桿菌染色鏡檢圖像進行自動提取、智能識別，進而部分降低相應(yīng)檢查項目對從業(yè)人員經(jīng)驗的依賴程度, 同時也減輕了操作者的勞動強度。

本研究結(jié)果顯示，AFB-AS檢測肺結(jié)核患者痰涂片的陽性率明顯高于傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢，并且對于低陽性級別痰標本，與傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢比較，AFB-AS對檢出抗酸桿菌具有一定的優(yōu)勢。因此，AFB-AS檢測肺結(jié)核患者痰涂片的敏感度也高于傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢；但其檢測特異度低于傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢。盡管兩種檢測方法的敏感度和特異度存在差異，但兩種方法對痰涂片抗酸桿菌判讀報告的等級相關(guān)系數(shù)為0.954，且均與分枝桿菌分離培養(yǎng)法具有較高的一致性。對于AFB-AS投入常規(guī)使用后，操作者需要注意的是，鑒于其識別抗酸桿菌的特異度低于傳統(tǒng)抗酸桿菌染色人工鏡檢，對于抗酸桿菌較少的玻片，有必要使用傳統(tǒng)鏡檢模式進行復(fù)檢。本文的結(jié)果及觀點與相關(guān)文獻報道一致[6-9]。

傳統(tǒng)抗酸桿菌染色鏡檢與AFB-AS的結(jié)果差異，主要出現(xiàn)在前者檢測陰性而后者檢測陽性的標本上，表現(xiàn)在AFB-AS能夠在部分含抗酸桿菌量較低的標本中實現(xiàn)對目標菌的檢出。這提示我們該系統(tǒng)研發(fā)者的初衷，似乎是盡可能減少“漏報”。在本研究中，AFB-AS檢測陽性而培養(yǎng)陰性的標本，經(jīng)Xpert檢測驗證的結(jié)果，能夠支持此推論。當然，這也說明AFB-AS在顯微放大倍數(shù)、抗酸桿菌軟件識別、抓取圖像分辨率、目標圖像識別算法等方面，仍有進一步提升的空間。

與AFB-AS實際投入應(yīng)用的場景比較，本研究在設(shè)計及實施過程中存在一定缺陷。本次研究未納入非結(jié)核病患者樣本進行對照，僅針對肺結(jié)核患者痰標本的檢測結(jié)果進行了分析。因此，AFB-AS的實際應(yīng)用性能，有待進一步驗證。同時，本文未對AFB-AS投入使用后，相應(yīng)項目實施的人工成本、經(jīng)濟成本進行比較分析；而針對其投入使用后，如何完善相關(guān)項目的質(zhì)量保障和質(zhì)量控制措施，有待進一步討論。

綜上，本研究結(jié)果表明，AFB-AS的檢測性能能夠滿足抗酸桿菌萋-尼染色臨床檢驗項目的要求。鑒于日常工作中，肺結(jié)核患者痰涂片抗酸桿菌染色鏡檢的陽性結(jié)果報告比例較低，而傳統(tǒng)閱片方法工作人員勞動負荷較大，加之AFB-AS可減少“漏報”的設(shè)計初衷，AFB-AS的推廣應(yīng)用，能夠在一定程度上減少工作負荷與人員數(shù)量、報告時效之間的矛盾的同時，能夠降低對判讀人員經(jīng)驗的依賴程度。