酸棗仁皂苷A促進大鼠股骨骨折愈合的機制研究

張兵 朱亞輝 王孝玉 周思私 袁發 胡凌云

據統計，骨折后延遲愈合或不愈合的比例約為10%[1-2]。其中骨折斷端處的炎癥反應被認為是骨折延遲愈合的重要原因之一[3]。酸棗仁皂苷A是從酸棗仁中分離得到的三萜皂苷，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡和神經保護等多種生物活性[4-5]。本研究團隊通過前期實驗發現，酸棗仁皂苷A可以通過激活生長轉化因子/骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路誘導小鼠胚胎成骨細胞前體細胞分化，形成骨組織，用于治療骨折延遲愈合或不愈合非常有潛力（尚待發表）。本研究通過構建大鼠股骨骨折模型，探討酸棗仁皂苷A是否通過NF-κB信號通路對骨折愈合產生促進作用，以期為臨床應用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠40只，體重（220±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（川）2020-030，使用許可證號：SYXK（川）2019-189。本實驗經南充市中心醫院醫學倫理委員會倫理審批通過[2021年審（032）號]。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 酸棗仁皂苷A（批號：A0274），純度≥98%，購自成都曼思特生物科技有限公司；BMP-2（批號：ab214821）、NF-κB 抑制劑蛋白-α（nuclear factor kappa B inhibitor protein，IκB-α）（批號：ab32518）、NF-κB 抑制蛋白激酶-β（nuclear factor kappa B inhibitor protein kinase，IκK-β）（批 號 ：ab178870）、NF-κB（批號：ab76302）和 β-肌動蛋白（β-actin）（批號：ab6276）抗體均購自艾博抗（上海）貿易有限公司；IL-1β（批號：ml003057）、IL-6（批號：ml102828）、TNF-α（批 號 ：ml002859）、ALP（批號：ml003360）、骨鈣素（bone gla protein，BGP）（批號：ml002883）ELISA 檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。VTE1600動物數字化X線影像系統購自南京普愛醫療設備股份有限公司；轉輪式切片機購自德國徠卡公司；TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀均購自常州市中威電子儀器有限公司；RS36型全自動染色機購自常州派斯杰醫療設備有限公司；BA210 Digital數碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實業集團有限公司；多功能凝膠成像儀、蛋白質電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與大鼠骨折模型的構建 將40只SD大鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、酸棗仁皂苷A低劑量組和酸棗仁皂苷A高劑量組4組，每組10只。大鼠經適應性喂養1周后，腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為30 mg/kg，3 g溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液中，1 ml/kg）進行麻醉。除空白組外，其余3組大鼠麻醉后構建左側股骨閉合骨折模型。待翻正反應消失后對大鼠進行局部脫毛，使用碘伏在大鼠左股骨髁間窩處消毒，將直徑1.0 mm克氏針從骨髁間窩處垂直刺入直達髓腔，拔出克氏針后于股骨中段處徒手折斷股骨，注意避免骨折移位，然后將克氏針從原穿針點插到斷骨遠端，剪斷克氏針外露部分，局部消毒后歸籠，蘇醒后正常飲食飲水。

1.3.2 給藥 造模后第2天開始，各組分別給藥，空白組與模型組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（20 ml/kg），酸棗仁皂苷A低劑量組腹腔注射10 mg/kg酸棗仁皂苷A（50 mg溶于 100 ml 0.9%氯化鈉注射液，20 ml/kg），酸棗仁皂苷A高劑量組腹腔注射20 mg/kg酸棗仁皂苷A（100 mg溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液，20 ml/kg）；1次/d，共28 d。給藥開始后28 d進行后續指標檢測。

1.3.3 大鼠骨折愈合情況觀察 各組大鼠于給藥開始后14、28 d使用動物數字化X線影像系統進行拍照，觀察各組大鼠骨折愈合情況。

1.3.4 大鼠骨折股骨骨痂病理學評分 給藥開始后28 d分離4組大鼠左側股骨，剔除分離軟組織，暴露骨痂，拔除髓內克氏針，取股骨中段處愈合骨痂進行石蠟封片（空白組于相同骨折位置取材），HE染色后在顯微鏡下拍照觀察，并進行評分：評分根據損傷處結締組織、軟骨、骨增生修復的程度，分為5級，以軟骨及骨組織占所有增生組織（包括結締組織、軟骨、骨組織）的比例記分，軟骨及骨組織占1/5者記為1分，軟骨及骨組織占2/5者記為2分，依此類推，損傷處完全由軟骨及骨組織取代者（即軟骨及骨組織占5/5）記為5分，分值越高，提示成骨效果越好。

1.3.5 骨折大鼠血清炎癥因子與骨形成因子檢測 大鼠給藥后28 d使用戊巴比妥鈉進行麻醉，收集腹主動脈血，分離血清，采用ELISA法檢測血清中炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）與骨形成因子（ALP和BGP）的含量。

1.3.6 大鼠骨痂組織中NF-κB信號通路BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。收集4組大鼠股骨中段處骨痂組織進行蛋白質提取并定量（空白組取相同骨折位置處骨組織），以每個樣本20 μg蛋白量依次進行凝膠電泳、轉膜、封閉，4℃過夜孵育一抗，一抗濃度為：BMP-2（1:800）、IκB-α（1:800）、IκK-β（1:800）、NF-κB（1:500）、β-actin（1:1 000），室溫條件下孵育二抗2 h，漂洗干凈后使用ECL試劑盒顯影，在凝膠成像系統曝光拍照，以β-actin作為內參反映蛋白表達水平。

2 結果

2.1 酸棗仁皂苷A對大鼠骨折愈合的影響 給藥開始后14 d，模型組骨折斷端邊緣模糊，骨痂量減少，骨密度低；酸棗仁皂苷A低劑量組斷端邊緣可見，骨痂量增多；酸棗仁皂苷A高劑量組斷端邊緣可見但接近消失，骨痂量增多。給藥開始后28 d，模型組大鼠股骨斷端邊緣仍不整齊，骨痂量雖有生成但不足以填滿缺損；酸棗仁皂苷A低、高劑量組斷端邊緣均完全消失，骨痂填滿缺損并與骨皮質相互連接，見圖1。

圖1 4組大鼠股骨動物數字化X射線影像系統攝片圖（箭頭所示為骨折處）

2.2 酸棗仁皂苷A對大鼠骨折組織病理學的影響 給藥開始后28 d，空白組股骨未見骨損傷區域，成骨結構完好。模型組股骨骨組織之間可見骨大面積損傷區域，斷端周圍大量新生骨小梁形成，斷端處較多纖維組織增生，見較多成纖維細胞和胞核呈長梭形的纖維細胞，未完全將斷端連接，大量炎性細胞浸潤，包括核呈圓形深染的淋巴細胞，亦見較多的新生血管形成；酸棗仁皂苷A低劑量組股骨骨組織之間可見骨大面積損傷區域，斷端周圍較多新生骨小梁形成，斷端處較多纖維組織增生，見成纖維細胞和纖維細胞，少量的纖維漿液性物質滲出，較多炎性細胞浸潤，以淋巴細胞和漿細胞為主，大量的新生血管形成，輕微出血；酸棗仁皂苷A高劑量組股骨骨組織之間可見損傷區域，面積較小，斷端周圍較多新生骨小梁形成，斷端處多量纖維組織增生，見成纖維細胞和纖維細胞，損傷區域中央見少量軟骨細胞形成，少量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主。各組大鼠骨痂病理學檢查情況見圖2（插頁）。與空白組相比，模型組大鼠骨痂病理學組織評分明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高、低劑量組骨痂病理學組織評分均升高（均 P＜0.05），見表1。

圖2 各組大鼠骨痂病理學檢查所見（HE染色）

2.3 酸棗仁皂苷A對骨折大鼠血清中炎癥因子的影響 給藥開始后28 d，與空白組相比，模型組大鼠血清中 IL-1β、IL-6與 TNF-α 含量均升高（均 P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高劑量組血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量均降低（均P＜0.05），但酸棗仁皂苷A低劑量組降低不明顯（均P＞0.05），見表2。

表2 4組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（ng/L）

2.4 酸棗仁皂苷A對骨折大鼠血清中骨形成因子的影響 給藥開始后28 d，與空白組相比，模型組大鼠血清中ALP與BGP含量均下降（均P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高劑量組血清中ALP與BGP含量均升高（均P＜0.05），但酸棗仁皂苷A低劑量組升高不明顯（均P＞0.05），見表 3。

表3 4組大鼠血清中ALP與BGP含量比較

2.5 酸棗仁皂苷A對骨折大鼠骨痂組織中NF-κB信號通路各蛋白的影響 與空白組相比，模型組大鼠骨痂中 BMP-2 蛋白表達水平降低（P＜0.01），IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達水平均升高（均P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高、低劑量組骨痂中BMP-2蛋白表達水平均升高（均P＜0.01），酸棗仁皂苷A高劑量組中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達水平均降低（均 P＜0.05），但酸棗仁皂苷A低劑量組降低不明顯（均P＞0.05），見圖 3和表4。

圖3 4組大鼠骨痂中骨形態發生蛋白-2（BMP-2）、NF-κB抑制劑蛋白 -α（IκB-α）、NF-κB 抑制蛋白激酶 -β（IκK-β）、NF-κB蛋白表達的電泳圖（β-actin為β-肌動蛋白）

表4 4組大鼠骨痂組織中 BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達水平比較

3 討論

近年來，人們為了探索更直接有效的骨折治療方案，對骨折愈合的過程進行了廣泛的研究和了解[6]。骨愈合分為直接愈合和間接愈合，前者是指不受外力影響的自然愈合，后者是指通過治療手段達到的愈合[7]。動物數字化X線影像系統攝片可以顯示骨折的具體情況，直接反映骨折的程度，同時也是判斷骨折是否愈合的有效方法之一。本實驗通過動物數字化X線影像系統攝片發現，模型組大鼠骨折后14 d骨折愈合速度緩慢，愈合程度低，28 d后仍未完全愈合。而使用酸棗仁皂苷A后，無論是高劑量組還是低劑量組骨折均快速愈合，28 d后基本愈合，說明酸棗仁皂苷A對股骨骨折具有促進愈合的作用。

骨折愈合大致可分為3個階段：血腫炎癥期、骨痂形成期和骨板形成塑型期，炎癥期會出現疼痛、組織腫脹和功能障礙等癥狀，嚴重的會產生骨裂，所以消除血腫炎癥、促進骨痂形成是促進骨折愈合的重要環節[8]。炎癥刺激會導致骨組織沉積和纖維細胞不斷增殖，使組織血管壁增厚，影響骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞，導致骨折延遲愈合[9]。本實驗通過對新生骨組織進行HE染色后發現，模型組股骨斷端處纖維細胞與炎性細胞聚集明顯，28 d后情況未好轉，說明血腫炎癥期仍在持續。使用酸棗仁皂苷A的兩組大鼠28 d后血腫炎癥期已經度過，具體表現為炎性細胞減少，骨小梁形成增多，并伴有軟骨細胞形成，血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量均明顯降低，說明酸棗仁皂苷A能促進骨痂的形成，加快骨折愈合。骨形成是骨折愈合的最后階段，ALP與BGP都是骨形成的標志。隨著成骨細胞的分化成熟，ALP去磷酸化后，磷酸根能與鈣離子結合形成磷酸鈣幫助骨形成；BGP是骨基質的成分之一，由于骨形成會吸收骨基質，在這個階段BGP會被釋放到血液中，成為反映骨代謝與骨周轉率的指標之一[10-11]。BMP在骨折愈合中通過調節細胞內信號通路，發揮刺激組織再生、成骨細胞分化、基因表達和細胞遷移等作用[12]。其中BMP-2會誘導骨髓間充質干細胞釋放BGP促進骨基質形成，通過細胞外鈣的流入和內質網鈣的釋放顯著增加了鈣的濃度，促進磷酸鈣的形成[13-14]，因此，BMP與成骨細胞的分化和骨形成有密切的關系。有研究發現，在濃縮間充質干細胞中持續單獨或共同傳遞BMP-2可在體外誘導軟骨形成和成骨，并在體內誘導顱骨缺損的軟骨再生[15-16]。本實驗發現，使用酸棗仁皂苷A后骨痂組織中BMP-2蛋白表達水平升高，說明成骨細胞正在快速分化與成熟，同時血清中ALP與BGP含量均明顯升高，說明骨形成正在進行，符合成骨的特征，提示酸棗仁皂苷A能促進骨折愈合。

為了探討酸棗仁皂苷A是否通過NF-κB通路降低炎癥反應來促進骨折愈合，本實驗對骨痂中NF-κB信號通路上的 IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達水平進行了檢測，結果發現，使用酸棗仁皂苷A后，IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達水平均明顯降低，說明骨痂組織中NF-κB信號通路被抑制，酸棗仁皂苷A可能通過抑制NF-κB通路來減少血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量，使骨折愈合階段中血腫炎癥期縮短并過渡到骨痂形成期和骨形成期，加速骨折愈合。

綜上所述，本實驗通過動物數字化X線影像系統攝片與病理學檢查明確酸棗仁皂苷A能促進骨折愈合；通過檢測血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量與骨痂中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達水平說明酸棗仁皂苷 A促進骨折愈合的機制是抑制炎癥通路，減少炎癥因子的釋放；最后通過檢測血清中ALP與BGP的含量與骨痂中BMP-2的表達明確酸棗仁皂苷A還具有促進骨形成的作用。但由于骨形成階段所涉及的因子與通路網十分復雜，本實驗只著眼于愈合前期的炎癥階段，對酸棗仁皂苷A誘導骨形成的機制尚未深入探討，今后將設計相應的實驗來進一步研究。