線粒體分裂抑制劑1對膠原誘導性關節炎小鼠疾病進展的抑制作用和機制

王曉艷 陳祝鋒 方瑜 周瑞 高飛

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節滑膜炎為主要病理表現的自身免疫性炎癥性疾病，滑膜局部表現為CD4+T淋巴細胞大量浸潤。研究發現滑膜局部調節性 T 細胞（regulatory T cells，Tregs）/Th17的失衡與RA疾病發生密切相關，通過調節兩者表達可達到緩解疾病的目的[1]。線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）通過抑制線粒體動力相關蛋白 1（dynamin-related protein 1，DRP1）的三磷酸鳥苷酶活性，抑制線粒體分裂，達到治療多種疾病的目的[2]。Li等[3]報道，Mdivi-1可通過抑制Th1/Th17細胞，促進Tregs的表達，抑制實驗性自身免疫性腦脊髓炎的疾病進展。本研究通過動物實驗來探討Mdivi-1是否可通過調節滑膜局部Tregs及Th17細胞的表達來抑制膠原誘導性關節炎（collagen induced arthritis，CIA）的進展，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料 7周齡雄性SPF級DBA/1小鼠16只，體重18～20 g，購自北京維通利華公司。Ⅱ型膠原（美國Chondrex公司，批號：20022）；弗氏不完全佐劑（美國Chondrex公司，批號：7002）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號：F5881）；二甲基亞砜（dihydroethidium，DMSO）（上海碧云天生物技術有限公司，批號：ST038）；Mdivi-1（美國 Sigma 公司，批號：M0199）；兔源IL-10多克隆抗體、兔源IL-17多克隆抗體、兔源叉頭狀轉錄因子（forkhead box protein 3，Foxp3）多克隆抗體、HRP標記山羊抗兔（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號依次為：GB11108、GB11110、GB11093、GB23303）。本實驗經陜西中醫藥大學倫理委員會審批通過。

1.2 CIA小鼠模型構建及治療 取相同體積Ⅱ型膠原和弗氏完全佐劑，冰上乳化15～20 min，待滴在水面不擴散即可，放置冰盒中備用。將小鼠固定，露出尾部，消毒，在距尾根部2 cm處皮下注射100 μl上述乳化劑。第21天，取相同體積Ⅱ型膠原和弗氏不完全佐劑，冰上乳化15～20 min，在距尾跟部3 cm處皮下注射100 μl。第28天，小鼠CIA模型構建成功，采用隨機數字表法分為DMSO組和Mdivi-1組，每組8只。隔日給予藥物干預，DMSO組給予1%DMSO（DMSO∶0.9%氯化鈉注射液=1∶100 稀釋）腹腔注射，0.5 ml/只；Mdivi-1 組給予Mdivi-1（0.2 mg Mdivi-1溶于5 μl DMSO中，然后用0.9%氯化鈉注射液稀釋100倍）腹腔注射，0.5 ml/只；均持續10 d。

1.3 關節炎評分 第21天后，小鼠陸續出現關節炎表現。從第28～37天，每日分別對每只小鼠的4個爪進行1次關節炎評分，評分標準如下：0分：正常；1分：單個關節輕度紅腫；2分：爪背、關節中度紅腫；3分：爪背、關節重度紅腫；4分：多個關節重度紅腫，伴有嚴重創傷。最高16分。兩位觀察者進行雙盲評分，取兩者平均值。

1.4 滑膜組織病理學檢測 第38天脫頸椎處死小鼠，解剖小鼠的膝、踝關節，置于10%多聚甲醛中固定。常規石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟至水，然后蒸餾水洗。HE染色，脫水封片，顯微鏡下拍照分析。

1.5 滑膜組織免疫組化檢測 常規石蠟包埋切片后，脫蠟至水，然后蒸餾水洗；依次進行抗原修復、滅活、一抗孵育（IL-10 1∶300，IL-17 1∶800，Foxp3 1∶300，用 PBS稀釋）、二抗孵育（1∶200）、DAB 顯色、復染返藍、脫水封片，最后進行顯微鏡下觀察并拍照分析，統計分析每組至少3個視野下陽性細胞數目百分比。

2 結果

2.1 兩組小鼠關節炎評分比較 Mdivi-1組小鼠第31、33、34、35、36、37 天關節炎評分均低于 DMSO 組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。Mdivi-1組關節炎癥狀較DMSO組明顯減輕，見圖1（插頁）。

表1 兩組小鼠關節炎評分比較（分）

圖1 兩組小鼠關節炎表現[a：二甲基亞砜（DMSO）組；b：線粒體分裂抑制劑 1（Mdivi-1）組]

2.2 兩組小鼠膝、踝關節滑膜組織病理學變化比較Mdivi-1組小鼠膝、踝關節滑膜組織炎癥細胞浸潤程度較DMSO組明顯減輕，見圖2（插頁）。

2.3 兩組小鼠膝、踝關節滑膜組織陽性細胞數目百分比比較 Mdivi-1組小鼠膝、踝關節滑膜組織Foxp3、IL-10的陽性細胞數目百分比均高于DMSO組，IL-17的陽性細胞數目百分比低于DMSO組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。兩組小鼠膝、踝關節滑膜組織免疫組化染色見圖3（插頁）。

圖3 兩組小鼠膝、踝關節滑膜組織免疫組化染色所見[a：二甲基亞砜（DMSO）組小鼠IL-10的表達；b：線粒體分裂抑制劑1（Mdivi-1）組小鼠IL-10的表達；c：DMSO組小鼠叉頭狀轉錄因子（Foxp3）的表達；d：Mdivi-1組小鼠Foxp3的表達；e：DMSO組小鼠IL-17的表達；f：Mdivi-1 組小鼠 IL-17 的表達；×20]

表2 兩組小鼠膝、踝關節滑膜組織陽性細胞數目百分比比較（%）

3 討論

RA是一種主要以關節滑膜炎為主要表現的自身免疫炎癥性疾病，RA關節滑膜組織中CD4+T淋巴細胞大量浸潤，提示RA是T細胞介導的免疫反應異常性疾病。CD4+T淋巴細胞由促進免疫應答的Th細胞和調節這些免疫應答的Tregs細胞組成。Th細胞因其分泌細胞因子的不同分為Th1、Th2、Th17細胞亞群。在RA滑膜組織中，Th1、Th17的表達明顯升高，通過分泌TNF-α、IL-17等炎癥因子加重滑膜炎，Tregs是CD4+CD25+Foxp3+的T細胞，通過分泌IL-10、細胞毒性 T淋巴細胞相關蛋白4等細胞因子抑制免疫反應[4-6]。眾所周知，通過調節局部Th1/Th17/Tregs的表達可達到緩解RA滑膜炎癥的目的。

研究指出，RA滑膜局部存在線粒體功能異常，表現為線粒體分裂增加，活性氧表達增加，線粒體氧化呼吸鏈復合體4的缺陷以及線粒體自噬增加等[7-10]。Mdivi-1是線粒體分裂抑制劑，能夠明顯抑制線粒體動力相關蛋白1的三磷酸鳥苷酶活性，并呈劑量依賴性下降[11]，從而抑制線粒體分裂。筆者前期研究指出，與對照組相比，RA患者滑膜組織中線粒體分裂明顯增加，對RA患者的滑膜成纖維細胞給予Mdivi-1干預后，可通過抑制蛋白激酶（protein kinase B，Akt）/IB 激酶（nuclear factor B kinase，IKK）/NF-κB 信號通路，降低細胞中炎癥性細胞因子環氧化酶-2及IL-8的表達，從而抑制細胞增殖及炎癥反應[12]。然而Mdivi-1是否會對CIA滑膜局部Th17/Tregs的表達產生影響，從而影響疾病進展，本課題進行了進一步的研究發現，在第28天對兩組CIA小鼠給予Mdivi-1治療后，與DMSO組相比，Mdivi-1組第31天起小鼠關節炎即明顯減輕，并逐漸明顯，同時滑膜組織病理顯示滑膜炎癥明顯減輕，提示Mdivi-1能夠有效減輕CIA小鼠滑膜炎癥的進展，改善關節炎。那么滑膜局部CD4+T淋巴細胞的表達有何變化呢？結果顯示，在應用Mdivi-1治療10 d后，第38天處死小鼠，檢測滑膜局部細胞因子發現：IL-17表達明顯下降，提示Mdivi-1可抑制滑膜局部Th17細胞的表達，抑制局部免疫炎癥反應，同時IL-10、Foxp3表達增加，由于Tregs細胞表面Foxp3陽性，提示Mdivi-1可能同時通過促進Tregs的表達，促進抗炎癥細胞因子的釋放，從而緩解CIA小鼠的疾病進展。然而，Mdivi-1對各型Th細胞轉錄因子的影響，及其能否通過調節外周血及淋巴細胞中CD4+T細胞分化，從而調節CIA小鼠全身免疫反應，仍需課題組后續研究進一步明確。

綜上所述，本研究采用CIA小鼠模型，觀察Mdivi-1對小鼠關節炎疾病進展及炎癥的影響。結果表明，Mdivi-1可能通過抑制關節滑膜局部Th17的表達，促進Tregs的表達，抑制CIA小鼠滑膜炎癥的進展，為RA的治療提供了新的方向。