基于線粒體ND1基因和核糖體ITS2基因對豬疥螨的分子鑒定

黃福強，唐志強，李靜，孫悅翔，鐘秉洲，戚少賢

（佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山528225）

疥螨病通常是指由疥螨科、疥螨屬的疥螨（Sarcoptes scabie）寄生于人和其他哺乳動物表皮內，引起稱為疥瘡（又稱疥癬、癲?。┑囊环N頑固性、接觸性和傳染性皮膚病[1]。疥螨的宿主種類較多，且地理分布廣泛，受環境因素的影響使疥螨的形態和生物學特性發生了一定的遺傳變異，因此采用傳統的分類學方法難以將不同宿主和不同地理來源的疥瞞進行分類[1,2]。一直以來，學者們對疥螨屬的螨蟲分類持有兩種截然不同的觀點，即不同宿主和地理來源的疥螨分離株應歸類為不同的種；不同宿主和地理來源的疥螨分離株應為一個種的不同變種，如疥螨人變種（Sarcoptes scabiei var.hominis）、疥螨豬變種（S.scabiei var.suis）和疥螨犬變種（S.scabiei var.canis）等。各變種之間在形態上差別甚微，對宿主特異性并不十分嚴格，如經常接觸家畜的人受到家畜疥螨的侵襲，也能轉移到人體上，但在生物學和致病性上有差異[1,2]。豬感染疥螨多發生在5月齡以前，通常由頭部開始，常發生在眼圈、頰部和耳朵等部位，癢感劇烈，有時患部因摩擦而出血。病程延長時，食欲不振，營養衰退，甚至死亡[2]，給養豬業造成了巨大的損失。

2020年10月作者收到廣東某豬場寄送給實驗室的患有豬皮膚病病例的皮屑時，通過鏡檢發現皮屑中存在疑似疥螨樣昆蟲尸體，為了進一步確診該豬場是否感染了疥螨病及初步探究本次所采集樣本與nt數據庫中疥螨的同源性以及疥螨亞目各種屬的進化關系，本研究以疥螨線粒體ND1基因序列和核糖體ITS2基因為靶標分子對所采集樣品進行分子鑒定及進化分析。

1 材料與方法

1.1 疥螨

采自廣東某豬場患皮膚病豬的皮屑。

1.2 儀器設備

雙人雙面凈化工作臺（青島海爾股份有限公司），電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠），LabCycler PCR儀UNO-II型（Biometra公司），小型高速冷凍離心機（Cenfrifuge 5424R），DYY-4C型電泳儀（北京六一儀器廠），JJ500型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠），XH-C旋渦混合器（金壇市華城開元實驗儀器廠），WFH-201-B全封閉紫外透射儀（廣州市深華生物技術有限公司）。

1.3 主要試劑

LB/Amp/X-gal/IPTG平板培養基，5 TBE buffer（pH 8.3），1%瓊脂糖凝膠，PBS，生理鹽水，Premix Tap，E.coli DH5感受態細胞，EcoR I酶，HindIII酶，DL2000Maker，TaKaRa MiniBEST Agarose Gel，DNA Extraction Kit Ver.4.0，Omega Bio-tek Stool DNA Kit（D4015-01），TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit。

1.4 疥螨總DNA提取

將從廣東某豬場采集的疥螨樣品按Omega Biotek Stool DNA Kit試劑盒所推薦的方法對皮屑樣品進行DNA提取，消化時間為5 h。

1.5 引物設計

疥螨ND1基因引物根據GenBank序列號為MF 083743的疥螨線粒體基因組ND1基因序列設計引物對ND1_F（5’-AGCGGAAGGTGAGTCAGAAATTG-3’）和ND1_R（5’-ACGAATACGAGGAAATCTACAACGA-3’），而ITS2基因引物對ITS2_F（5’-GGGCTGCAGTATC CGATGGCTTCGT-3’）和ITS2_R（5’-CGGGATCCTT CRCTCGCCGYTACT-3’）參考自文獻[3]，此引物擴增出來的序列包含了5.8S rDNA基因部分序列、ITS2基因全部序列以及28S rDNA基因部分序列[3]，本實驗中對該序列命名為“ITS2+”。兩基因引物對由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.6 目的基因片段PCR擴增

1.8 PCR產物的克隆及測序

用TaKaRa pMDTM18-T載體克隆試劑盒推薦的方法進行擴增片段的克隆和轉化；利用TaKaRa質粒純化試劑盒所推薦的方法對重組質粒進行抽取，然后在0.2 mL的EP管中配制20L的酶切反應體系并在37℃水浴2 h后進行電泳檢測。將酶切反應陽性的菌樣送樣，并委托生工生物工程（上海）有限公司對其測序。

1.9 生物信息分析

1.9.1 blastn相似性比較為了獲取本次測序的ND1基因及ITS2+序列與nt數據庫中疥螨目已有相關基因序列相似性高低，本研究在nt數據庫中以“Sarcoptiformes and(nd1 or nad1)”為檢索詞搜索疥螨目的ND1基因，共獲得66條序列；以“Sarcoptiformes and(ITS2 or internal transcribed spacers 2)”為檢索詞，共獲得663條ITS2基因相關序列。以下載的上述兩組疥螨目ND1及ITS2基因序列分別作為測序所得ND1和ITS2+序列的目標數據庫。通過本地blastn程序，按照命令“blastn-query query_name-db database_nameout result_name-evalue 1E-5-max_hsps 1-max_target_seqs 1000”進行局部比對，blastn比對結果用circoletto（http://tools.bat.infspire.org/circoletto） 進行優化（由于nt數據庫對中ITS2基因序列過多，可視化時blastn結果比中Alignment length、Percentage of identical matches、Expect value、Bit Score及物種信息都相同的序列僅保留一條）。

1.9.2 進化分析為了應用本次測序的ND1基因及ITS2基因序列分析不同動物及地區分離的疥螨屬基因突變情況及進化關系，應用MEGA-X軟件對測序數據和nt數據庫中下載到的19條疥螨屬ND1基因[以Sarcoptes and(nd1 or nad1)進行檢索]和301條ITS2基因[以“Sarcoptes and(ITS2 or internal transcribed spacers 2)”進行檢索]進行比對并構建系統發生樹。由于ITS2基因序列較多，進化分析時相同宿主來源序列只保留一條最長的ITS2基因序列，共有56條nt數據庫中的序列參與建樹。構建進化樹時先用MEGA-X軟件嵌套的ClustalW程序對本次測序獲得的ND1基因及ITS2基因和nt數據庫中下載的相應基因序列進行（默認參數）比對，然后手動校正得到的矩陣，對同一基因的所有序列都修剪到相同的長度，然后采用最大似然法（ML）構建系統發育樹，各分支的支持率利用自展法（Bootstrap,1 000次重復）進行檢驗，ND1基因以塵兔癢螨（Psoroptes cuniculi）為外群，ITS2基因以貓背肛螨（Notoedres centrifera）為外群。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增

利用DNA提取試劑盒提取皮屑總DNA，然后再行PCR擴增、轉染和酶切。經1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增片段大小，其中ND1基因擴增序列在200 bp左右，ITS2基因擴增序列在400 bp左右，均與預期擴增片段大小相符，見圖1。

2.2 blastn相似性比較

通過檢索nt數據庫發現，nt數據庫中分別有66條ND1和663條ITS2基因相關序列（截止2021年3月14日），通過blastn比對（E-value<1E-5）發現疥螨目中共有56條線粒體ND1基因序列與本實驗獲得的ND1基因序列有比對結果（圖2 A），且本實驗獲得的ND1基因部分序列與19個疥螨（Sarcoptes scabiei）線粒體基因組ND1基因相似性最高（紅色彩帶對應序列，Identity>99%，E-value<6.20E-106），其次是戶塵螨（Dermatophagoides pteronyssinus，NC_012218.1，EU884425.1，Identity=80%，E-value=1.37E-44）、兔癢螨（Psoroptes cuniculi，NC_024675.1，KJ957822.1，Identity=74%，E-value=9.84E-34）和粉塵螨（Dermatophagoides farinae，NC_048990.1，GQ465336.1，Identity=74%，E-value=4.18E-32）（綠色彩帶對應的序列）；本實驗獲得的ITS2+序列與疥螨屬ITS2基因序列相似性最高，與其他疥螨目ITS2序列差異較大（圖2 B），但blastn結果提示在現有的nt數據庫序列中疥螨屬與背肛螨屬（Notoedres）ITS2基因序列最為相似（比對序列長度為85~89，比對序列部分相似性為95.50%~97.80%，E-value為7.16E-35~4.83E-37）。以上結果表明本次測序獲得的序列為疥螨屬基因組中的基因序列。

圖2 疥螨豬變種ND1序列（A）和ITS2+（B）序列與疥螨目相應基因序列blastn比對結果紅色彩帶代表E-value值相對最小，橙色次之，綠色再次之，藍色最大，彩帶寬度表示比對序列長度。Fig.2 The blastn comparisons of the Sarcoptes scabiei var.suis against the ND1 and ITS2 sequences in the NT database.The red lines connect DNA sequences with the lowest quartile of e-value and blue lines with the highest quartile of E-value.The line width means the alignment length.

2.3 序列比對及分子進化樹構建

本次擴增的ND1基因序列長度為211 bp，運用擴增的ND1基因序列長度及其全長序列分別構建進化樹，結果顯示本次擴增獲得的長211 bp的ND1基因序列與澳大利亞地區犬、考拉和袋熊真皮內采集到的疥螨屬基因序列聚類（圖4 A）。ND1全長序列分析顯示nt數據庫中現有19條ND1基因全長序列可以聚為5個分支（分支中序列數大于等于2條，bootstrap值大于50%）（圖4 B），而以本次擴出的211 bp長度僅僅有2個聚類。但不論是全長聚類還是部分序列聚類，聚類序列中均有不同來源的動物。ITS2基因聚類分析顯示，疥螨屬所有57條序列及背肛螨屬的4條序列能各自聚為一大類，疥螨屬序列和背肛螨屬序列明顯地分開，但在參與建樹的57條（包含本實驗獲得的序列）疥螨屬ITS2基因序列中，僅有6條序列可以先形成2個小的聚類，其他51條序列沒有聚類，見圖3。

圖3 基于核糖體ITS2基因構建的疥螨環狀進化樹Fig.3 The circle ML phylogenetic trees of rDNA ITS2 of Sarcoptes mites

3 討論

形態學鑒定發現來自不同地區或動物的雌性疥螨分離株在形態學上有所差異，但有些研究也發現即使是來自同一分離株的不同個體疥螨也存在差異[3]。因此在形態學上很難說清楚雌性疥螨形態的差異是由不同分離株引起還是由不同的個體引起。隨著分子標記技術的發展，研究員期望通過DNA分子標記技術來闡明疥螨各地區或不同宿主的遺傳變異關系。

由于核糖體RNA基因和線粒體基因受到的選擇壓力較小，進化率快，在絕大多數的真核生物中表現出了極為廣泛的序列多樣性，因此常用核糖體DNA的ITS區域和線粒體基因作為蟲種鑒定分子標記[4]。近年來對疥螨的分子鑒定往往應用ITS2基因序列作為分子標記，有些研究也應用疥螨CO1等線粒體基因進行進化分析[5,6]，但還未見ND1基因用于疥螨各變種基因變異分析的文章。隨著高通量測序技術的發展，已有不同動物來源的疥螨線粒體全基因組被解析[6,7]。疥螨ND1基因全序列也已通過第二代測序方法拼接完成[6,7]，鑒于此，本研究應用了疥螨分析常用的核糖體ITS2基因及目前為止還未用于疥螨分類和進化分析的線粒體ND1基因序列。

本試驗中ITS2基因序列分析結果顯示，所獲得序列與nt數據庫中疥螨屬各變種ITS2基因相似度最高，與疥螨亞目中背肛螨屬進化關系相對較近，且所有疥螨的ITS2序列能聚類在一起，有較高的自展值（99），然后再與外群聚類。同時疥螨屬內部聚類時ITS2僅有少部分序列能有分支聚類。Zahler等[3]1999年在對疥螨ITS2序列分析時發現來自四大洲9種不同宿主的23株疥螨分離株的變異程度較小，建議將各地分離株歸為一個獨立的種，S.Alasaad[8]和Li等[9]也于2009年和2018年通過擴增世界各地收集到的疥螨ITS2基因序列及GenBank中登錄的疥螨ITS2基因進行分析，指出ITS2在疥螨各變種間變異非常小，無法對采至不同地區或不同動物的疥螨ITS2序列進行有效聚類。本試驗也發現雖然ITS2作為分子標記能有效地區分疥螨亞目中不同屬的螨蟲，如癢螨、背肛螨等，但由于在疥螨屬內ITS2基因序列差異很小，無法區分疥螨屬內其他的種或變種。通過對ITS2基因序列的分析，本試驗也支持疥螨屬各分離株為單獨種的結論。

本試驗中ND1基因序列分析結果顯示，所獲得序列也與nt數據庫中疥螨屬各變種ND1基因相似度最高，其次為戶塵螨、兔癢螨和粉塵螨，且疥螨屬內各變種進化分析顯示，有部分疥螨ND1基因序列可以分支聚類，但聚類的序列與采集的地區和宿主種類無關，且ND1基因全長序列的分支聚類要比部分序列多，說明不同分離株ND1基因序列變異位點信息比ITS2基因變異位點信息豐富，且ND1基因全長序列變異位點要較本次擴增序列多。在以后的實驗中，應用ND1基因全長序列對不同地區或不同宿主來源的疥螨進行分析，將會獲得更多有效變異位點信息。

最后，通過本次試驗得出在廣東某豬場豬皮膚結痂中發現的昆蟲樣生物為疥螨，且本實驗再次驗證常用的ITS2基因序列不宜作為疥螨屬內各變種變異進化分析的分子標記，但本實驗所篩選出的ND1基因在疥螨各變種中有較豐富的變異位點信息，可以作為疥螨屬內各變種進化分析的有效候選分子。