基于浸泡法的鮻耳石鍶標記技術(shù)研究

郭 彪，王 碩，張博倫，劉克奉，陳 衛(wèi)，楊 健，姜 濤，曾祥茜，于 瑩

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300457，2.天津市海洋牧場技術(shù)工程中心，天津 300457，3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究員淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081）

鮻（Liza haematocheila）隸屬鯔形目（Mugiliformes），鯔科（Mugilidae），鮻屬，是亞洲地區(qū)鯔科魚類中最主要的經(jīng)濟代表種，廣泛分布與我國南海、東海、黃海和渤海。因鮻的食性為植食性或腐屑食性，主要攝食環(huán)境中的有機碎屑［1］，可起到凈化養(yǎng)殖水域的作用，對維持水域生態(tài)平衡和優(yōu)化環(huán)境具有重要作用［1］，因此鮻一直以來都是我國增殖放流的重要品種［2］。以天津市為例，2006—2018年，總計放流鮻7 347.302萬尾，是所有海洋魚類放流品種中數(shù)量最多的一個品種。全面、科學(xué)地分析評估放流取得的實際效果是保證工作有效開展的基礎(chǔ)［3］，而放流個體標記和回捕率分析是目前放流效果評估的主要方法［4］。因此，近年來標記技術(shù)作為近海漁業(yè)生態(tài)修復(fù)領(lǐng)域的科學(xué)問題之一被廣泛研究［5－7］。

目前，關(guān)于增殖放流魚類標記的方法有掛牌標記、被動整合式雷達標、分子標記和耳石微化學(xué)標記等［8］。不同的標記方法有各自的特性和適用范圍，要根據(jù)放流物種的實際情況進行選擇［4］。國內(nèi)鮻的增殖放流一般選擇體長3～5 cm的苗種，放流數(shù)量較大、放流企業(yè)較多，且存在魚苗遺傳背景信息不清的問題。由于掛牌標記和被動整合式雷達標要求魚苗體長較大且適合小規(guī)模標記［8－10］，而分子標記需要清晰的親本遺傳信息［11］，制約了標記技術(shù)在鮻增殖放流中的廣泛應(yīng)用，因此需要開發(fā)一種適合大規(guī)模放流小規(guī)格鮻的標記方法。

由于耳石是一種具有新陳代謝惰性的鈣化結(jié)構(gòu)［12］，沉積在耳石中的生境元素能永久性保存，可以很好地記錄魚類生境的變遷［13］。因此，一直以來耳石微化學(xué)分析作為一種重要技術(shù)手段，用于魚類生境的重建和種群的鑒定［14－15］。隨著學(xué)者們對大規(guī)模小規(guī)格魚類標記方法的探索，耳石鍶標記技術(shù)逐步由標記淡水魚類［16］向標記海水魚類［17］發(fā)展。與淡水及河口魚類耳石Sr／Ca比值與生境中的Sr／Ca比值直接相關(guān)不同，海水中的Sr／Ca比值不是影響海水魚類耳石Sr／Ca比值的主要因素［18］，海水魚類耳石Sr／Ca比值可能受到海水環(huán)境中的Sr和Ca的相對濃度、魚類種類特性、水溫、鹽度和魚類生理狀態(tài)等多種情況的影響［19］。因此，海水中鍶濃度對海水魚類耳石Sr／Ca比值的影響，需分種類進行區(qū)別研究。本研究擬比較不同濃度鍶浸泡下，鮻的存活率和耳石標記效果，以探討鮻耳石鍶標記的可行性，為大規(guī)模鮻耳石鍶標記放流提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚的來源及暫養(yǎng)

實驗用魚為河北省黃驊市宏潤水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司繁育的體長1 cm左右的幼魚。幼魚運回實驗室后，在實驗室馴化水系統(tǒng)中的3個600 L的立方養(yǎng)殖池中暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間，每天投喂配合飼料2～3次，日補水量約為10%，暫養(yǎng)海水為自然海水，鹽度21～23、水溫21～22℃、pH 7.83～8.03。

1.2 標記實驗方法

實驗開始前對海水中Sr2＋質(zhì)量濃度進行測定，為7.9 mg·L－1。通過向海水中添加SrCl2·6H2O將海水中Sr2＋質(zhì)量濃度分別提升至50、100、200、400 mg·L－1。其中，Sr2＋質(zhì)量濃度400 mg·L－1的海水Sr2＋濃度處于過飽和狀態(tài)，海水呈乳白色。

在50 L的實驗水族箱中盛Sr2＋質(zhì)量濃度分別為50、100、200、400 mg·L－1的海水，作為不同Sr2＋質(zhì)量濃度標記組，分別用M50、M100、M200、M400代表50、100、200、400 mg·L－1試驗組；同時，將無添加SrCl2·6H2O的自然海水單獨注入一個50 L的實驗水族箱，作為對照組，用C0表示。

挑選體長1 cm左右、健康的幼魚500條，均勻分配到4個標記組和一個對照組，開始實驗。每隔6 h觀察一次各處理組中幼魚的存活情況。整個標記期間不換水，每天正常投喂2～3次。標記48 h后，分別將每個處理組中的全部幼魚單獨轉(zhuǎn)移到一個盛有自然海水600 L的立方養(yǎng)殖池（循環(huán)系統(tǒng)的一個養(yǎng)殖池）進行后期飼養(yǎng)。待幼魚長至約10 cm左右時，每個處理組隨機挑選5尾魚進行耳石微化學(xué)分析。后期飼養(yǎng)期間，養(yǎng)殖用水和養(yǎng)殖管理同暫養(yǎng)，每天觀察幼魚的死亡狀況，并做好記錄。

1.3 耳石檢測方法

1.3.1 耳石摘取及前處理

利用剪刀、尖頭鑷等工具將一對矢耳石取出，剔除有機質(zhì)，分別用去離子水、無水乙醇清洗，置于48孔盒中干燥備用。從一對矢耳石中隨機選取一塊用于前處理和微化學(xué)分析，前處理參照李孟孟等［20］的方法，先將耳石用Epofix環(huán)氧樹脂進行固定包埋，38℃烘干12 h以上。然后將包埋塊用AB膠粘貼于干凈的載玻片上，凝固2 h后，使用金剛石磨輪的碾磨機（Discoplan-TS型，Struers公司）切割碾磨。粗磨階段用500目金剛砂輪碾磨至耳石微露，接著用1 200目砂紙精磨至耳石核心暴露，然后用磨拋機（Labo Pol-35，丹麥Struers公司）裝備織布機拋光盤配合拋光液拋光，至耳石表面無明顯劃痕。最后將樣品放入Milli-Q水中超聲清洗5 min后，自然條件下晾干24 h，完全干燥后，使用真空鍍膜機（JEE-420，日本電子株式會社）蒸鍍碳膜（36A，25 s）。

1.3.2 耳石的EPMA分析

耳石的EPMA分析參考楊健和劉洪波［21］、司飛等［17］的方法，利用X射線電子探針微區(qū)分析儀（JXA-8100型EPMA，日本電子株式會社）從耳石核心沿耳石最長徑至耳石邊緣呈直線進行耳石鍶元素定量線分析。標準樣品使用碳酸鈣（CaCO3）和鈦酸鍶（SrTiO3）。定量線分析（line transect analysis）EPMA的參數(shù)設(shè)定：加速電壓為15 kV，電子束電流為2.0×10－8A；束斑直徑為3μm，每點駐留時間15 s；以間距10μm連續(xù)進行打點測定。所有耳石線分析完后用電子束在耳石矢狀面表面掃描進行面分析（mapping analysis）。其EPMA加速電壓和電子束電流分別為15 kV和5.0×10－7A，束斑直徑為3μm，像素為6μm×6μm，每點駐留時間為0.03 s。由于耳石中Sr含量遠小于Ca含量，按照國際慣例將Sr／Ca比值標準化，即統(tǒng)一用Sr／Ca×103表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和Spss19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素（one-way ANOVA）進行方差分析或χ2檢驗，利用Excel 2010和SigmaPlot 1.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標記期間與標記后鮻存活情況

在標記期間，各處理組均未發(fā)生鮻死亡情況；標記后養(yǎng)殖期間，各處理組均有一定比例鮻死亡，經(jīng)χ2檢驗，χ2值為0.984，P＞0.05；各處理組之間在標記期間和標記后養(yǎng)殖期間存活率均沒有顯著性差異。

2.2 不同標記濃度鮻耳石上鍶元素的面分布

對50、100、200、400 mg·L－1浸泡組和對照組鍶元素在耳石上沉積的面分布進行上機分析。4個標記濃度處理組的5個樣本均出現(xiàn)明顯的“高鍶標記環(huán)”（圖1）。

圖1 不同鍶濃度處理后鮻耳石鍶元素面分布結(jié)果Fig.1 Sr concentrations of mapping analysis in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

2.3 不同標記濃度鮻耳石上鍶元素線性分析

通過定量線分析可知，50、100、200、400 mg·L－1浸泡組的Sr／Ca比值均在距核200μm附近出現(xiàn)增高階段（圖2）。線性分析結(jié)果表明Sr2＋質(zhì)量濃度50～400 mg·L－1，標記時長為48 h，鮻均被成功標記。

圖2 不同處理組鮻耳石樣品定量線分析結(jié)果Fig.2 Line transect analysis in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

將鮻耳石Sr／Ca比值的變化分成平穩(wěn)階段和顯著變化階段，并對其不同階段的數(shù)值進行單因素方差分析，分析結(jié)果見表2。4個不同標記濃度組和對照組平穩(wěn)階段鮻耳石Sr／Ca比值未發(fā)現(xiàn)存在顯著性差異（P＞0.05）。M50組和M100組鮻耳石Sr／Ca比值顯著變化階段的均值顯著低于M200組和M400組（P＜0.05），M400組鮻耳石Sr／Ca比值顯著變化階段的均值顯著高于其他3個標記組（P＜0.05）；Sr／Ca的峰值、Sr／Ca峰值為正常均值的倍數(shù)在不同處理組間的差異規(guī)律與Sr／Ca比值顯著變化階段的差異規(guī)律均值一致。4個不同標記濃度組鮻耳石形成的標記環(huán)寬度值也存在顯著性差異（P＜0.05），其中M50組顯著低于M200組和M400組（P＜0.05），但M100組、M200組和M400組3個處理組鮻耳石形成的標記環(huán)寬度沒有顯著性差異（P＞0.05）。鮻耳石Sr／Ca比值峰區(qū)均值為正常均值的倍數(shù)在4個不同標記濃度組存在顯著性差異（P＜0.05），M400組顯著高于其他標記組（P＜0.05），而M50組、M100組和M200組未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。

表2 不同處理組鮻耳石Sr／Ca比值變化Tab.2 Change of Sr／Ca ratio in marked otoliths of L.haematocheila in different treatments

對耳石Sr／Ca峰值、Sr／Ca顯著變化階段均值和標記環(huán)寬度分別與海水中Sr2＋濃度進行關(guān)系擬合，擬合結(jié)果見表3。從表3中可知，Sr／Ca峰值（即Ⅲ階段Sr／Ca比）、Sr／Ca顯著變化階段均值（即Ⅱ階段Sr／Ca比）與海水中Sr2＋濃度呈明顯的線性關(guān)系，其擬合方程的R2值分別為0.999和0.987，而標記環(huán)寬度分別與海水中鍶離子濃度擬合的線性方程R2值為0.824，但其擬合的對數(shù)方程R2值為0.967。

表1 標記期間與標記后鮻的存活情況Tab.1 Survival situation of L.haematocheila during marking or after marking

表3 耳石Sr／Ca參數(shù)指標與標記海水Sr 2＋濃度擬合結(jié)果Tab.3 Correlation of Sr／Ca parameter index of otoliths and Sr 2＋concentration of seawater used in marking

3 討論

標志性放流是科學(xué)區(qū)分放流群體和自然群體、準確評估增殖放流效果的基礎(chǔ)［22］。由于鮻放流個體較小和遺傳背景不清晰，采用掛牌標記、被動整合式雷達標、分子標記等標記方法進行鮻的標記性放流，效果不是十分理想。耳石微化學(xué)標記作為一種小規(guī)格魚類大規(guī)模標記的理想手段，已經(jīng)在大黃魚（Larimichthyscrocea）［22］、牙鲆（Paralichthysolivaceus）［17］等海水魚中得以驗證。本研究中4個標記濃度處理組鮻耳石均出現(xiàn)明顯的“高鍶標記環(huán)”的結(jié)果，說明采用耳石鍶標記技術(shù)對小規(guī)格鮻進行標記是可行。在整個標記實驗中，即使是海水Sr2＋濃度處于過飽和狀態(tài)的情況下，48 h內(nèi)鮻也沒有出現(xiàn)死亡情況，標記后的58 d養(yǎng)殖期間，標記組鮻的存活率也與對照組基本一致。這與王臣等［23］、李秀啟等［16］、司飛等［17］和張翼等［24］報道的外源Sr濃度對大麻哈魚（Oncorhynchusketa）、鳙（Aristichthysnobilis）、牙鲆和黑鯛（Sparusmacrocephalus）幼魚未產(chǎn)生任何影響的結(jié)果一致。綜上，將耳石鍶標記技術(shù)作為鮻小規(guī)格苗種大規(guī)模標記的方法是可行的、安全的。

本實驗中Sr／Ca峰值、Sr／Ca比值顯著變化階段的均值和標記環(huán)的寬度均隨著標記海水中Sr2＋濃度的增加逐漸增高，但3個參數(shù)指標與海水中Sr2＋濃度進行關(guān)系擬合結(jié)果卻有所不同。其中Sr／Ca峰值和Sr／Ca比值顯著變化階段的均值與海水中Sr2＋濃度的關(guān)系為線性關(guān)系，擬合結(jié)果說明鮻耳石中的Sr／Ca比值與水體中的Sr／Ca比值呈正相關(guān)關(guān)系，這與司飛等［17］對牙鲆的研究結(jié)果一致。而標記環(huán)寬度與海水中Sr2＋濃度擬合的線性方程R2值為0.824，但其擬合的對數(shù)方程R2值為0.967，這表明鮻耳石高鍶標記環(huán)的寬度與水體中Sr／Ca是呈對數(shù)關(guān)系變化的。在高鍶海水標記下鮻耳石形成標記環(huán)的寬度其實與鍶元素在魚類耳石沉積的時滯特征有關(guān)［25－26］，考慮到本實驗期間鮻僅在標記期間海水Sr2＋濃度不同，因此本實驗不同處理組之間標記環(huán)寬度的差異只可能與標記濃度、鮻耳石的生長規(guī)律有關(guān)。鮻耳石隨個體發(fā)育生長而增大，二者呈冪函數(shù)關(guān)系，冪指數(shù)小于1，耳石初期增長率較大，后期漸緩［27］。而魚類在不同Sr2＋濃度標記后，其耳石Sr／Ca恢復(fù)到正常水平所需時間的比較性研究尚未見報道。筆者推測，隨著標記采用的Sr2＋濃度升高，高濃度Sr2＋在鮻耳石沉積的時滯越長，這些高濃度Sr2＋隨著鮻的生長逐漸沉積，最終恢復(fù)到正常的耳石Sr／Ca水平［26，28］；但是這需要進一步深入研究加以證實。

關(guān)于海水魚耳石微化學(xué)鍶標記過程中采用的標記海水Sr2＋濃度的報道不多。大黃魚在12 mg·L－1Sr2＋的海水中浸泡7 d，其耳石出現(xiàn)明顯的鍶元素指紋標記［22］。司飛等［17］在對牙鲆進行72 h耳石微化學(xué)鍶標記的實驗中發(fā)現(xiàn)，Sr2＋質(zhì)量濃度為9.19 mg·L－1的海水未能成功標記，Sr2＋質(zhì)量濃度為11.16 mg·L－1的海水僅對部分樣品成功標記，而Sr2＋質(zhì)量濃度為19.06 mg·L－1的海水成功標記了所有樣品。由于本實驗設(shè)計的最低標記濃度為50 mg·L－1Sr2＋，添加的鍶元素遠比文獻中報道的添加濃度高，這也是本實驗中所有標記組樣品均出現(xiàn)明顯“高鍶標記環(huán)”的原因。依據(jù)實驗結(jié)果，50 mg·L－1Sr2＋的標記濃度完全可以實現(xiàn)小規(guī)格鮻苗種大規(guī)模標記的需求。

雖然魚類耳石中形成的鍶標記穩(wěn)定性強［17］且該方法非常適合于小規(guī)格苗種大規(guī)模標記，但是隨著魚類個體生長，其耳石逐漸變大，面分析檢測比例尺變小，鍶標記變細、模糊。為保持標記分析結(jié)果的清晰，放流評估回捕魚類的面分析監(jiān)測比例尺必須增大，尤其是標記環(huán)所處位置部分。本研究結(jié)果顯示，1 cm鮻標記環(huán)出現(xiàn)的位置在距核200μm附近。因此，對回捕鮻進行面分析時，建議在距核100～300μm處加大面分析比例尺，以便準確分析回捕鮻是否是標記魚類。