朊病毒病免疫治療的研究進(jìn)展

李書翔/海南大學(xué)生命科學(xué)與藥學(xué)院生物科學(xué)專業(yè) 570228

朊病毒病又稱傳播性海綿狀腦 病（transmissible spongiform encephalopathy，TSE）是一種由朊病毒（PrPSc）引起的疾病，其主要臨床特點(diǎn)往往表現(xiàn)為迅速進(jìn)展的癡呆，肌悻攣控作和運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)，大腦中可見海綿樣變、膠質(zhì)增生及淀粉樣斑塊，但無炎癥反應(yīng)及包涵體。發(fā)生在人體內(nèi)的朊病毒疾病包括克-雅病（Creutzfeldt-Jakob Diseasd，CJD），古-斯綜合征（Gersmann-Straüssler Syndrome，GSS），致死性家族失眠癥（fatal familial insomnia，F(xiàn)FI），及庫(kù)魯病（Kuru），發(fā)生在動(dòng)物的有羊瘙癢癥、傳染性水貂腦病、麋鹿和騾鹿慢性消耗病以及瘋牛病。朊病毒病的病原體—朊病毒是一種正常的朊蛋白（PrPC）由于構(gòu)象改變而錯(cuò)誤折疊形成的富β片層的異常蛋白。其擁有著抗高熱、抗消毒滅活、抗紫外線、抗蛋白酶K 能力水解的能力，同時(shí)擁有免疫耐受，對(duì)人類的身體健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)有著相當(dāng)大的威脅。目前尚無有效的朊病毒清除方法。

免疫治療是用藥物調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，使機(jī)體對(duì)疾病產(chǎn)生恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的治療方法，在人類歷史上很早就被應(yīng)用，直到現(xiàn)在依然在公共衛(wèi)生健康事業(yè)與畜牧獸醫(yī)方面發(fā)揮中流砥柱作用。本文從免疫治療的兩大方向—主動(dòng)免疫治療和被動(dòng)免疫治療，闡述研究人員近年來以來對(duì)治療朊病毒病所做出的嘗試，為研究者了解相關(guān)領(lǐng)域提供參考。

1 針對(duì)被動(dòng)免疫途徑的治療

1.1 PrPc 抗體利用被動(dòng)免疫途徑治療朊病毒病的最常規(guī)方法是利用朊病毒特異性抗體，然而由于朊PrPSc 與PrPc 之間只有構(gòu)象差異，因此目前制備朊病毒特異性抗體還存在一定難度，所以大多數(shù)研究還是將目光放在了PrPc抗體上。獲得可用的PrP 抗體首先需要通過將合成的PrPc 肽、重組PrPc 或從組織中純化的天然PrPc 作為抗原，免疫Prnp 基因缺陷的動(dòng)物以獲得相關(guān)抗體，再利用初步得到的抗體制備特異性高的單克隆抗體。目前科學(xué)家們已經(jīng)篩選出了多種能與PrPc 結(jié)合的單克隆抗體，如6D11、6H3、L42、ICM37 等。不過各種PrPc 單克隆抗體在實(shí)驗(yàn)中針對(duì)朊病毒感染表現(xiàn)的效果并不完全相同，有研究認(rèn)為這取決于各類單克隆抗體與PrPc 結(jié)合的表位：只有結(jié)合到特定表位的單克隆抗體如SAF15、SAF32才可以抑制PrPSc 積累，否則還有可能致使病情加重。

與小分子藥物不同，雖然所有到達(dá)外周神經(jīng)系統(tǒng)的抗體都可以預(yù)防或減少朊病毒感染和傳播的風(fēng)險(xiǎn)，不過要想真正治愈朊病毒感染，保護(hù)脆弱的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抗體將會(huì)面臨血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的阻擋。在這種情況下，全長(zhǎng)抗體甚至單價(jià)小分子抗體片段都難以穿過，這導(dǎo)致絕大部分PrPc 抗體在朊病毒病臨床癥狀發(fā)作后無效。幸運(yùn)的是，單鏈抗體（single chain Fv，ScFv）被證明有較強(qiáng)的擴(kuò)散能力，可以穿透BBB，有效到達(dá)病灶。研究人員們發(fā)現(xiàn)，由重組腺病毒載體運(yùn)輸?shù)腄18scFv 成功到達(dá)了朊病毒易感小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，并且在外周接種朊病毒后，延長(zhǎng)了小鼠發(fā)病潛伏期，降低了中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)PrPSc 含量。另外一項(xiàng)針對(duì)駱駝PrPc 抗體PrioV3 研究的也給出了相似的結(jié)果：PrioV3 抗朊病毒抗體能有效地穿越BBB，減少體內(nèi)朊病毒的復(fù)制。同時(shí)該抗體在體外實(shí)驗(yàn)中成功治愈了PrPSc 感染細(xì)胞，并且沒有像在小鼠體內(nèi)培養(yǎng)的常規(guī)抗朊病毒抗體一樣觸發(fā)神經(jīng)毒性效應(yīng)。這些能夠穿透BBB 的PrPc 抗體為治愈臨床癥狀出現(xiàn)后的朊病毒疾病帶來了希望。但是PrPc 抗體還面臨著在體內(nèi)易被降解等一系列問題。

1.2 LRP/LR 抗體

LRP/LR 是非整聯(lián)蛋白37/67 kDa層粘連蛋白受體，體外證明其為PrPSc在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和聚集所必需的蛋白。而且已有一系列研究表明對(duì)其下調(diào)和抑制可以緩解朊病毒感染。其中值得注意的是，多克隆抗LRP/LR 抗體（W3）被證明可以治愈PrPSc 增殖細(xì)胞。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過向小鼠腹膜內(nèi)注射W3，然后對(duì)小鼠接種朊病毒，結(jié)果W3 處理的小鼠外周PrPSc 減少了66%，存活率與對(duì)照組相比增加了1.8倍，并且W3 處理沒有影響脾臟中正常的PrPc 水平或僅使其有微弱下降。此外，該實(shí)驗(yàn)還表明W3 處理的小鼠在已經(jīng)具有神經(jīng)癥狀的臨床階段時(shí)仍然有效。平行實(shí)驗(yàn)將LRP/LR 的單鏈抗體scFv S18 通過腹膜內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)，降低了PrPSc 在外周組織內(nèi)的增殖，且明顯延長(zhǎng)小鼠的臨床發(fā)病潛伏期，不過scFv S18 的效果相比于W3 要稍差一些，可能是因?yàn)檠褐腥L(zhǎng)IgG 的半衰期相比scFv 更長(zhǎng)。

1.3 LTβR 抗體

LTβR 全稱為淋巴毒素β 受體，其抗體（LTβR-Ig）能阻止淋巴毒素β（lymphotoxinβ）與濾泡樹突狀細(xì)胞的LTβR 結(jié)合，而以上過程是成熟濾泡樹突狀細(xì)胞形成和維持所必需的。因此LTβR 抗體可以導(dǎo)致成熟濾泡樹突狀細(xì)胞的暫時(shí)缺失。有研究表明，在朊病毒在進(jìn)入小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前，大量存在于脾臟內(nèi)的濾泡樹突狀細(xì)胞中，在對(duì)該小鼠施加以 LTβR 抗體治療后，成功消除了朊病毒的聚積，并且延緩了朊病毒對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵襲。但是該抗體僅對(duì)處于發(fā)病早期或者潛伏期的患者有效，在臨床階段無力阻止疾病的進(jìn)一步發(fā)展。

1.4 分子伴侶樣抗體朊病毒的發(fā)生和擴(kuò)散與細(xì)胞內(nèi)外發(fā)生的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集有關(guān)，因此，尋找蛋白質(zhì)復(fù)性的方法成為了清除朊病毒的又一思路。在活細(xì)胞中，分子伴侶可協(xié)助新生肽鏈正確折疊。類似的，一個(gè)特定配體同樣可能影響目標(biāo)蛋白構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，而分子伴侶樣抗體就屬于這樣的配體。該類抗體的與抗原接觸后，使天然的抗原構(gòu)象與現(xiàn)有的抗原構(gòu)象間的平衡發(fā)生偏移或穩(wěn)定兩種構(gòu)象的折疊過渡狀態(tài)以降低構(gòu)象轉(zhuǎn)變的活化能，以此使得抗原的構(gòu)象向原有構(gòu)象轉(zhuǎn)變。目前β 片層形成阻斷肽分子伴侶樣抗體被廣泛用于治療和朊病毒病相似的阿爾茲海默癥。其作用機(jī)制是與富含β 折疊的蛋白質(zhì)如PrPSc 特異性結(jié)合，通過以上機(jī)制使β 片層結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性遭到破壞，從而促使PrPSc 的構(gòu)象向正常的PrPc 的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。此外，β 片層形成阻斷肽還可以通過抑制雷帕霉素靶蛋白來促進(jìn)細(xì)胞自噬，清除異常聚集的β 淀粉樣蛋白，而之前已有研究證明促進(jìn)細(xì)胞自噬可以有效清除朊病毒，因而不能排除β 片層形成阻斷肽促進(jìn)細(xì)胞自噬的機(jī)制同樣能夠緩解朊病毒病的可能。β 片層形成阻斷肽已經(jīng)被用于對(duì)抗阿爾茲海默癥，也有理由期待其在朊病毒病治療中得到實(shí)際應(yīng)用。

2 針對(duì)主動(dòng)免疫途徑的治療

目前，主動(dòng)免疫在預(yù)防各類疾病中正發(fā)揮著越來越重要的作用。雖然朊病毒由于與PrPc 有著相似的結(jié)構(gòu)而無法刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，但學(xué)者們還是希望通過各種方法激活機(jī)體對(duì)朊病毒的免疫功能，以此實(shí)現(xiàn)朊病毒疫苗的研發(fā)。

鑒于抗原呈遞在免疫應(yīng)答中的重要作用，研究人員希望通過加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)抗原的呈遞誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生有效的特異性免疫。利用聚乳酸-聚乙醇酸微球體包裹重組鼠PrP23-231=PrP23-231二聚體免疫小鼠，并輔以CpG-寡聚核苷酸增強(qiáng)免疫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠成功誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的PrPc 抗體，而且增強(qiáng)了小鼠體內(nèi)CD4+T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)。除此之外，研究者試圖針對(duì)抗原提呈的經(jīng)典胞內(nèi)途徑研發(fā)可行的DNA 疫苗，即使用能夠表達(dá)帶有泛素、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)產(chǎn)物的Prnp真核表達(dá)載體促進(jìn)抗原呈遞。在該實(shí)驗(yàn)采用的聯(lián)合免疫策略中，分別用這三種核酸疫苗和對(duì)照組以及PrP23-231 蛋白聯(lián)合免疫小鼠。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，這種聯(lián)合免疫策略可以打破朊病毒的免疫耐受，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生良好的體液免疫，而且包含加強(qiáng)了抗原提呈作用的核酸疫苗的實(shí)驗(yàn)組在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫中表現(xiàn)更好。

此外，還有研究人員設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證利用消化道黏膜免疫預(yù)防外源朊病毒感染的可行性。在該實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)小鼠 PrPc 的沙門氏菌被作為口服疫苗的活載體對(duì)小鼠進(jìn)行胃內(nèi)免疫以誘導(dǎo)PrPc 特異性分泌型IgA（Seeretory IgA，SlgA），隨后用感染朊病毒的小鼠腦組織勻漿經(jīng)實(shí)驗(yàn)小鼠口腔進(jìn)行攻擊。結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗原特異性sIgA 和IgG 較少，但有30%免疫組小鼠能防御朊病毒疾病。病毒攻擊后500d，存活的小鼠組織中未見PrPSc沉積，并且其它患病小鼠的病情減輕，平均存活時(shí)間延長(zhǎng)。不過在實(shí)際應(yīng)用中，黏膜免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體將絕大部分消耗在食物內(nèi)的PrPc 上，因此未來科學(xué)家還需解決的問題是主動(dòng)免疫后機(jī)體產(chǎn)生抗體的特異性問題。

3 結(jié)語

迄今為止，朊病毒病的死亡率仍然為100%，尚無任何一種上市藥物可以有效治愈朊病毒病。在尋找朊病毒病的免疫治療方法過程中，不少研究的后續(xù)進(jìn)展也并不迅速，諸如抗體的擴(kuò)散分布能力、半衰期以及特異性問題仍有待解決。當(dāng)然，利用免疫方法治療朊病毒病已經(jīng)為我們開辟了新方向，同時(shí)，利用抗體檢測(cè)朊病毒也已經(jīng)在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣為應(yīng)用，相信隨著研究人員們對(duì)朊病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制進(jìn)一步地探索研究，可以在臨床上有效減緩乃至治愈朊病毒病的免疫治療方法最終將被研發(fā)出來。