Xanthomonas oryzae pv.oryzae LAMP可視化檢測方法的建立

王 星，柴文棟，楊 俊，張小芳,姬廣海

(1.河南省舞鋼市質量技術檢驗測試中心，河南 舞鋼 462500；2.河南省舞鋼市棗林鎮中心小學,河南 舞鋼 462500;3.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650000)

1 引言

水稻是我國重要的糧食作物，我國水稻栽培面積占世界水稻栽培總面積的20%。造成水稻大量減產的細菌性第一病害水稻白葉枯病是由Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)引起的。帶菌種子傳播是該病害傳播的主要途徑之一，在種子市場監管中由于缺乏高效的檢測方法，往往造成帶菌種子在市場中流通，給市場監管工作帶來不必要的麻煩，目前常用的水稻白葉枯病菌檢測方法主要根據病害特征識別和實時熒光PCR方法，但是這些方法效率低且成本貴的不足之處，因此，建立一個高效、準確的帶菌種子的檢測方法十分必要。

LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)又被稱為“環介導等溫擴增反應”，國外相關學者發明的一種新型、快速、簡便的核酸擴增方法[1]。LAMP具有操作簡便，成本低、易識別、靈敏度高等優點，此外該技術還可用于體外難培養甚至無法培養的病原菌的檢測，例如病毒的檢測。目前，LAMP檢測技術已被國內外眾多學者成功用于各類病原菌的檢測[2～4]。該方法具有簡單、快速和靈敏的特點。因此，相對落后的普通PCR技術有望被LAMP技術在菌物檢測中替代。

本研究建立了一種利用可視化環介導等溫核酸擴增技術(LAMP)檢測水稻白葉枯病原菌Xoo的方法。采用SYBR Green l染料法對擴增產物閉管檢測，可視化快速得到結果，通過該研究以期基層市場監管中監測水稻白葉枯病菌提供新的技術手段。

2 材料與方法

2.1 供試材料

(1)供試菌株。供試的水稻白葉枯病菌(X.aryzaepv.oryzae)菌株由本實驗室從云南省各個水稻白葉枯病發病區分離所得；供試的對照菌株包括水稻細菌性條斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola)、甘蘭黑腐病菌(X.campestrispv.campestris)、柑桔潰瘍病菌(X.axonopodispv.citri)、常春藤葉斑病菌(X.campestrispv.hedera)、番茄斑點病菌(X.campestrispv.Vesicatoria)、丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepv.syringae)、香蕉細菌性枯萎菌(Burkholderiasolancearum)，保存于云南農業大學生物多樣性國家工程。

(2)水稻樣品。水稻植株感病樣品分采自云南省德宏傣族景頗族自治州瑞麗市、芒市和景洪市水稻白葉枯病發病田塊；水稻種子樣品由云南省德宏傣族景頗族自治州農業局提供，稻種分為雜交稻和常規稻，均為當地主栽品種。

(3)試劑及儀器。Bst DNA polymerase large fragment(M0275S)，dNTPs，SYBR Green I購于北京百泰克生物有限公司，NA固體培養基，LB液體培養基，H886S12型恒溫水浴鍋，移液器，漩渦振蕩儀，EasyPure Plant Genomic DNA Kit(全式金)，UJ200 0.2 mL Hi-Tube Dome Cap。

2.2 試驗方法

2.2.1 細菌基因組DNA的提取

(1)細菌DNA的提取。參考于源華[5]的簡便高效提取細菌總DNA的方法。用接種分別挑取各供試菌株于NA平板劃線，置28 ℃培養箱過夜培養，然后挑取單菌落接種于15mL的LB液體培養基，置28 ℃，160 r/min搖床過夜振蕩培養。取1～3 mL菌液，12000 r/min，5 min，離心收集菌體，棄上清；加入 200 μL dd H2O，吹打重懸。加入 200 uL 酚/氯仿(1∶1)，渦旋混勻。13000 r/min，2 min，取上清，重復步驟一次；取上清，加入2倍體積無水乙醇和1/10體積5 M NaCl，混勻。13000 r/min，5 min，棄上清，保留沉淀。該沉淀即為細菌總 DNA 樣品；500 μL 75% 乙醇洗滌一次。室溫敞口放置 5 min 晾干，加入 20 μL dd H2O溶解沉淀。用核酸蛋白儀測量所提樣品DNA的純度及核酸濃度，-20 ℃保存。

(2)水稻稻種總DNA的提取。根據全式金植物基因組總DNA提取試劑盒(EE111-01)說明書進行供試水稻稻種樣品總DNA的提取。測量所提樣品DNA的純度及核酸濃度，加滅菌超純水或TE(pH 8.0)溶解后-20 ℃保存。

2.2.2 LAMP引物設計

本研究針對水稻白葉枯病菌假定蛋白的特異保守區域設計引物，水稻白葉枯病菌的LAMP引物序列源于水稻白葉枯病菌標準菌株PXO99的DNA序列(GenBank 登錄號：PRJNA28127)。用Bioedit軟件進行序列分析，使用Primer Explore V 4.0在線軟件自動生成的引物，根據引物設計原則使用PrimeSelect軟件檢查引物的二級結構，篩選出特異性高的LAMP引物(表1)。由昆明碩擎生物科技有限公司合成引物，用ddH2O溶解后分裝，-20 ℃冰箱保存備用。

表1 水稻白葉枯病菌LAMP檢測引物序列

2.2.3 LAMP反應體系的建立

LAMP檢測反應體系為25 μL含:10 x Thermopol Buffer 2.5 μL, dNTP(2.5 mmol/L)4.0 μL,FIP(10 μmol/L)和BIP(40 μmol/L)各1.0 μL, LF(10 μmol/L)和LB(10 μmol/L)各0.5 μL, F3(40 μmol/L)和B3(10 μmol/L)各2.0 μL, MgSO4(100 mmol/L)1.0 μL,Bst DNA polymerase 4U, DNA模板或菌懸液2 μL，加ddH2O補足至25 μL。將反應混勻并離心，陰性對照不加模板。在LAMP反應開始前，向反應管內蓋子上加入10 X SYBR Green I 熒光染料1 μL。將各反應管插入在漂浮板上，并依次置于65 ℃恒溫加熱1 h，80 ℃加熱5 min使酶失活終止反應，瞬時離心并觀察反應的溶液顏色，陽性反應熒光綠色，陰性反應則為橙色，試驗進行3次。

2.2.4 LAMP特異性檢測

以水稻白葉枯病菌的近緣細菌及其他種細菌(對照菌見供試菌種1.1)為對照菌檢測LAMP方法的特異性。采用1.2.3己建立的反應體系進行LAMP檢測，通過熒光染料法檢測結果。

以水稻白葉枯病菌的近緣細菌為對照菌檢測LAMP方法的特異性。對照菌包括水稻條斑病菌、甘蘭黑腐病菌、柑桔潰瘍病菌、黃單胞菌常春藤葉斑病菌。按照百泰克細菌基因組DNA提取試劑盒說明書，分別提取供試菌株的基因組DNA，進行LAMP擴增，測定LAMP反應的特異性。利用己建立的反應體系進行LAMP檢測，反應結束后通過熒光染料法以及瓊脂糖凝膠電泳分析檢測結果。

2.2.5 LAMP靈敏度檢測

以水稻白葉枯病菌總DNA和菌懸液為模板進行靈敏度分析。通過梯度稀釋使DNA濃度依次為100 ng/uL、10 ng/uL、1 ng/uL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL；將在NA培養基上培養24 h后的白葉枯病菌配置成菌懸液，利用分光光度計測定濃度OD600nm=0.3(約3×108cfu/mL)，通過梯度稀釋使得濃度依次為3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL、3×102cfu/mL、3×101cfu/mL。采用2.2.3己建立的反應體系進行LAMP檢測，通過熒光染料法檢測結果。

2.2.6 樣品檢測

市售稻種(楚粳28號)、兩優2161以及采集的疑似感病種子取5粒(約0.1 g)，放入1.5 mL的離心管中，在無菌微型管中研磨粉末狀，加入500 μL無菌水水浸泡30 min。感病的水稻葉片按照植物DNA提取試劑盒(北京百泰克生物有限公司)進行提取。采用2.2.2己建立的反應體系進行LAMP檢測，通過熒光染料法檢測結果。

3 結果

3.1 特異性檢測的結果

分別以水稻白葉枯病菌的總DNA及近源細菌DNA為模板，用已經建立的反應體系進行LAMP特異性檢測。結果顯示:以水稻白葉枯總DNA為模板的反應管反應液顏色變為熒光綠色，其他7個對照菌株和空白對照則仍為橙色(圖1)。水稻白葉枯病菌病菌LAMP靈敏度檢測結果表明LAMP引物設計完全可以區分水稻水稻白葉枯病菌和其他近源菌種，具有特異性。

注：1.水稻白葉枯病菌2.水稻細菌性條斑病菌3.甘蘭黑腐病菌4.柑桔潰瘍病菌5.常春藤葉斑病菌6.番茄斑點病菌7.丁香假單胞菌8.香蕉細菌性枯萎菌9.空白對照

3.2 靈敏度檢測的結果

分別以不同濃度的白葉枯總DNA和水稻白葉枯菌菌懸液為模板，用已經建立的LAMP體系進行靈敏度分析。結果如下：當水稻白葉枯病菌總DNA濃度為100 ng/μL、50 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、50 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL均可觀察到顏色變化(圖2)；當水稻白葉枯病菌的懸浮液濃度為3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL時，均可觀察到顏色變化(圖3)。水稻白葉枯病菌LAMP靈敏度檢測結果表明LAMP方法對菌株DNA檢測最低值為100 fg/μL，菌懸液檢測最低值為3×103cfu/mL。

注：1.100 ng/uL；2.10 ng/uL；3.1 ng/uL；4.100 pg/uL；5.10 pg/uL；6.1 pg/uL；7.100 fg/uL；8.10 fg/uL；9.1 fg/uL；10.空白對照

注：1.3×108 cfu/mL；2.3×107 cfu/mL；3.3×106 cfu/mL；4.3×105 cfu/mL；5.3×104 cfu/mL；6.3×103 cfu/mL；7.3×102 cfu/mL;8.3×101 cfu/mL；9.空白對照

3.3 稻種、稻株樣品檢查結果

以采集的疑似感病水稻樣品及市售稻種的植物總DNA為模板，用已經建立的檢測體系進行檢測。SYBR Green I熒光染料法檢測結果見圖4，具體分析結果見表2，LAMP檢測結果若為橙色，表明均未攜帶水稻白葉枯病菌；LAMP檢測結果為熒光綠色，表明攜帶水稻白葉枯病菌。由檢測結果可知：從三個地區采集的疑似水稻白葉枯病感病葉片均攜帶病原菌，由德宏州農業局提供的稻種樣品中，有三個攜帶有水稻白葉枯病原菌。

表2 水稻樣品進行LAMP檢測結果

注：熒光綠色表示陽性結果；橙色表示陰性結果

4 結論與討論

本研究以水稻白葉枯病菌為研究對象，利用 Primer Explorer V4.0設計軟件，設計了4條普通LAMP引物和2條特異LAMP環引物，反應只需在65 ℃恒溫下反應1 h，利用SYBR Green I作為熒光指示劑，水稻白葉枯病菌呈熒光綠色的陽性反應，對照菌株則保持不變。LAMP完全可以對水稻白葉枯病菌和其近源菌種進行檢測，反應檢測靈敏度DNA為100 fg/μL，菌懸液為3×103cfu/mL。

目前在生產上水稻白葉枯病害往往造成嚴重危害[6]，但沒有有效的防治辦法，而種子是重要的傳染源之一，因此在市場監管過程中及早檢測帶菌種子，對預防該病害具有重要意義。在病原細菌的分子診斷中, 16S rRNA基因(16S rDNA)、23S rRNA基因(23S rDNA)、16S～23S rRNA間區、IS1113扦入序列等常被選用的靶基因。然而，研究表明這兩個基因是相同的，用這些基因不能檢測鑒定這兩個密切相關的變種[7]。

國內外鮮見水稻白葉枯病原菌的環介導恒溫擴增方法報道。目前國內僅僅有湛彥超[8]報道利用水稻白葉枯病原菌基因組DNA特有的保守區域設計LAMP引物，通過優化反應體系，檢測系統的水稻白葉枯病。本研究與前者研究相比，本研究有三個改進之處。其一，引物設計選取的靶標序列不同。前者研究中應用GENBANK網站上的BLAST軟件進行比對，選取 5個匹配度均在98%的水稻白葉枯病原菌基因組，而本研究是根據水稻白葉枯病原菌的假定蛋白基因序列設計LAMP引物。其二，前者研究只設計出一對外引物和一對內引物。Nagamine等[9]研究發現，假如采用環引物(Loop primers)，反應時間就會減少一半以上，本研究篩選到了一對環引物，加快LAMP擴增的速率，縮短檢測時間。其三，對LAMP擴增產物結果的判斷方法不一樣。前者試驗過程中經過高溫，因此往往會產生的氣溶膠，從而容易導致污染，致使檢測結果會出現假陽性。此外，瓊脂糖凝膠電泳法由于電泳前向膠孔中點樣后，所點樣的擴增產物并不會完全沉降，因此會影響靈敏度的檢測，同時用凝膠電泳方法對LAMP檢測結果進行判斷非常浪費時間，這是不能滿足快速檢測的要求。而本研究采用了不開蓋判定結果，具有可視性、即時性的檢測的優點，并且避免了開蓋后可能會造成的氣溶膠污染。相比之下，染料顏色的變化不僅可以提高肉眼的識別率，而且可以直接用于市場監管過程中的診斷，是最為簡單方便的LAMP結果判定方式，因此檢測的準確性和靈敏度更有保證。