VEGF-C、VEGFR-3在食管癌診治中的臨床價值

盧來順，林雪瓊，曾蕓珠

(1．汕頭市中心醫院超聲診斷科，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院檢驗科，廣東 汕頭 515041；3．汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院病理科，廣東 汕頭 515041)

食管癌是全球常見的惡性腫瘤，我國是全球食管癌發病率和病死率最高的國家之一，每年平均新發病例數約22.3萬，死亡人數約15萬[1]。轉移和復發是導致患者死亡的主要原因，淋巴源性轉移是食管癌轉移的主要途徑和影響其預后因素之一[2]。血管內皮細胞生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)和血管內皮細胞生長因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)是促進淋巴管生成的重要因素[3-4]，亦有大量報道VEGF-C、VEGFR-3在食管鱗癌中的表達。然而，暫未查閱到有關VEGF-C、VEGFR-3與多種蛋白表達及其與食管癌患者預后的關系的報道。本文旨在探討VEGFC、VEGFR-3蛋白表達與食管癌臨床病理特征、患者預后的關系及其與凋亡抑制蛋白Survivin等蛋白的關系，進一步明確VEGF-C、VEGFR-3在食管癌診治中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 標本來源

收集2014年5月—2016年4月汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院病理科收檢的部分食管癌手術標本134例。其中男性108例，女性26例；年齡43～78歲，平均年齡(59.99±7.79)歲，中位年齡60歲。根據第八版食管癌TNM分期標準進行分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期98例，Ⅳ期16例。其中無淋巴結轉移50例，有淋巴結轉移84例。選取食管癌切除術后恢復良好出院的病例進行跟蹤隨訪，隨訪時間截止到2018年5月，隨訪時間7～36個月。本研究經汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑

兔抗人VEGF-C多克隆抗體、鼠抗人VEGFR-3單克隆抗體均購于北京中杉金橋生物公司，兔抗人Survivin多克隆抗體、兔抗人EGFR單克隆抗體、兔抗人Ki-67單克隆抗體、鼠抗人p53單克隆抗體、即用型免疫組化MaxVision二抗及DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物公司。

1.3 實驗方法

標本均經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規制片、HE染色。免疫組化染色步驟按EnVision兩步法進行：石蠟標本3 μm厚連續切片，65℃烤片1 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各2 min，PBS洗3次，3 min/次，3%H2O210 min，抗原修復(VEGF-C、Ki-67、p53采用pH=6.0，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液高壓修復；VEGFR-3、EGFR采用pH=9.0 EDTA高溫修復)，PBS洗3次，3 min/次，加1滴一抗37℃孵育1 h，PBS洗3次，3 min/次，加1滴二抗室溫15 min，PBS洗3次，3 min/次，加1滴DAB顯色5 min，流水終止顯色，蘇木精復染1 min，分化，返藍，脫水，透明，中性樹膠封固。

1.4 結果判斷

蛋白表達均以細胞著色情況為標準，陽性染色為棕黃色，凡顯色強度與背景無明顯差別為陰性。先在低倍鏡下選取最強著色區，然后選10個高倍鏡視野(400×)，分別計數100個細胞，按其出現特異性染色顏色深淺參考文獻評分[5-7]：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按染色細胞所占百分比計分：陰性為0分，陽性細胞數＜10%為1分，10%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將兩項得分結果相乘：≥3分為陽性，其中3～4分為(+)，5～7分為(++)，8～9分為(+++)。

1.5 統計學方法

應用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計數資料以例數或百分率表示，VEGF-C、VEGFR-3表達與患者臨床病理特征的關系采用χ2檢驗；VEGFC、VEGFR-3表達與4種常見蛋白的關系采用Spearman等級相關檢驗；VEGF-C、VEGFR-3表達與患者生存時間的關系，單因素生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素生存分析采用Cox風險比例回歸模型法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管癌組織中的蛋白表達

VEGF-C、VEGFR-3蛋白主要定位于細胞質和癌巢周圍間質細胞，呈棕黃色顆粒狀，灶性或彌漫性分布，多出現在癌巢的邊緣部位(圖1A、圖1B)；Survivin蛋白主要定位于細胞質，在細胞核中也有少量表達(圖1C)；EGFR蛋白主要在細胞質/膜中表達(圖1D)；Ki-67、p53蛋白定位于細胞核(圖1E、圖1F)。

圖1 食管癌組織中的蛋白表達 (MaxVisionTM法，×200)

2.2VEGF-C、VEGFR-3表達與食管癌臨床病理特征的關系

134例食管癌標本中，VEGF-C蛋白陽性105例(78.36%)，VEGFR-3 蛋白陽性 92 例(68.66%)。淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組的VEGF-C陽性率分別為88.10%(74/84)和62.00%(31/50)，VEGFR-3陽性率分別為77.40%(65/84)和54.00%(27/50)，差異均有統計學意義(P＜0.05)，且與淋巴結轉移個數有關，淋巴結轉移個數越多，VEGF-C、VEGFR-3陽性率越高。VEGF-C表達與腫瘤浸潤深度有關(P＜0.05)，VEGFR-3表達與腫瘤浸潤深度無關(P＞0.05)；兩者表達與患者性別、年齡、神經束是否浸潤、腫瘤分化程度均不相關(P＞0.05，表1)。

表1 VEGF-C、VEGFR-3表達與食管癌臨床病理特征的關系

2.3 食管癌組織中VEGF-C、VEGFR-3與Survivin、EGFR、Ki-67、p53表達的相關性

VEGF-C、VEGFR-3與Survivin的表達呈正相關(P＜0.05)，而與EGFR、Ki-67、p53的表達無關(P＞0.05，表2)。

表2 食管癌組織中VEGF-C、VEGFR-3與Survivin、EGFR、Ki-67、p53表達的相關性

2.4VEGF-C、VEGFR-3蛋白表達與食管癌患者生存時間的關系

在134例食管癌患者中，44例患者隨訪期間死亡，90例患者隨訪至2018年5月仍生存。單因素分析發現，VEGF-C低表達患者中位生存期長于高表達者(32.670個月vs 28.215個月，P=0.049，圖2)；VEGFR-3低表達患者中位生存期亦長于高表達者(32.183個月vs 27.630個月，P=0.025，圖3)；淋巴結轉移與食管癌患者的生存時間密切相關，差異有統計學意義(P=0.004，圖4)。將VEGF-C、VEGFR-3表達及各臨床病理特征導入Cox回歸模型進行多因素生存分析，結果表明淋巴結轉移是食管癌患者的獨立預后預測因子 (OR=2.297，95%CI： 1.031～5.118，P=0.042)，但VEGF-C、VEGFR-3不是食管癌患者的獨立預后預測因子(OR=1.921，95%CI：0.640～5.764，P=0.244 和 OR=1.515， 95%CI： 0.663～3.462， P=0.325)。

圖2 VEGF-C蛋白不同表達的食管癌患者的生存曲線

圖3 VEGFR-3蛋白不同表達的食管癌患者的生存曲線

圖4 淋巴結有無轉移的食管癌患者的生存曲線

3 討論

腫瘤的擴散和轉移是治療失敗的主要原因，而在腫瘤轉移這一因素中，區域淋巴結轉移是腫瘤復發及遠處轉移的主要原因[8]，淋巴源性轉移是食管癌轉移的主要途徑和影響預后的因素之一。VEGF-C是血管內皮生長因子家族成員之一，通過酪氨酸激酶受體VEGFR-3促使內皮細胞增殖、遷移和淋巴管生成，與腫瘤的淋巴結轉移有關，在胃癌[9]和乳腺癌[10-11]等多種腫瘤的研究中已得到證實。本組實驗應用免疫組化法對134例食管癌VEGF-C、VEGFR-3的表達進行檢測，陽性率分別為78.36%、68.66%，這與既往研究食管鱗癌中表達陽性率比較一致[12]。本研究表明VEGF-C、VEGFR-3的表達與食管癌的淋巴管浸潤、淋巴結轉移密切相關。

食管癌的發生、發展是多因素綜合作用的結果，在分子水平上涉及眾多癌基因、抑癌基因及蛋白質的改變。Survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員[13]，具有抑制腫瘤凋亡、促進腫瘤異常增殖等特點，與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關[14]。Yan等[15]研究Survivin表達與放化療后食管鱗狀細胞癌患者的臨床病理特征及預后的關系，發現Survivin的表達與腫瘤大小、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度、淋巴結轉移、臨床分期密切相關，高表達Survivin的患者預后不良。乳腺癌中，VEGF-C的表達水平與Survivin的表達水平存在顯著相關，且VEGF-C參與了Survivin介導的乳腺癌細胞侵襲過程[14]，本研究結果顯示VEGF-C、VEGFR-3與Survivin在食管癌組織中的表達呈正相關。

EGFR是原癌基因C-erbB-1的表達產物，是表皮生長因子受體家族成員之一。EGFR廣泛分布于上皮細胞、成纖維細胞、膠質細胞、角質細胞等細胞表面，研究表明EGFR在與其配體結合后可以引起細胞生長、增殖和分化，在正常的細胞生理過程中發揮十分重要的調控作用[16]。EGFR蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常可促進腫瘤細胞的增殖、血管生成、浸潤和轉移，以及抑制細胞凋亡[17]。Ki-67是目前評估腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一，可判斷腫瘤侵襲力及預后[18]。p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因，p53基因的功能發生缺陷則可導致人體細胞異常增殖[19]。p53基因好似“基因組衛士”，在G1期檢查DNA損傷點，監視基因組的完整性。如果p53基因發生了突變，對細胞的增殖失去控制，則導致細胞癌變[20]。p53蛋白主要分布于細胞核中，在正常細胞中p53蛋白的表達水平通常低于免疫組化方法的檢出水平，p53基因突變可導致突變型p53蛋白的積聚和過度表達。既往研究報道，胃癌、卵巢上皮癌中VEGF-C和EGFR的表達呈正相關[21-22]，乳腺癌中VEGF、p53、Ki-67的表達呈正相關[23]；也有研究顯示食管癌中p53蛋白的表達與VEGF表達無密切關系[24]，田興松等[25]研究發現EG-1 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達與VEGF-C蛋白顯著相關，與p53蛋白無相關性。本研究中VEGF-C、VEGFR-3與EGFR、Ki-67、p53的表達不相關。這可能與本研究納入的食管癌標本大部分為食管鱗狀細胞癌有關。此外，更多的研究傾向于將蛋白的表達分為陰性和陽性2個等級，本研究分為4個等級進行分析亦可能是影響因素之一。

此外，本組病例進行了跟蹤隨訪，結果顯示VEGF-C、VEGFR-3低表達患者的中位生存期長于高表達者。除了VEGF-C、VEGFR-3表達外，單因素分析數據還提示淋巴結轉移與食管癌患者的生存時間密切相關。眾所周知，腫瘤的發生發展是多因素、多過程的，影響其預后的因素紛繁復雜，于是我們將VEGF-C、VEGFR-3表達及各臨床病理特征導入Cox回歸模型進行多因素生存分析，結果表明淋巴結轉移是食管癌患者的獨立預后預測因子，但VEGF-C、VEGFR-3不是食管癌患者的獨立預后預測因子。結果提示VEGFC、VEGFR-3表達水平高的患者其死亡風險較表達低的患者大；有淋巴結轉移的患者，其死亡風險也越大；VEGF-C、VEGFR-3表達越高的食管癌患者，其生存時間越短。

綜上所述，食管癌組織中VEGF-C、VEGFR-3表達的高低與患者是否伴有淋巴結轉移密切相關，與凋亡抑制蛋白Survivin的表達呈正相關。VEGF-C、VEGFR-3表達越高提示食管癌患者伴有淋巴結轉移可能性越大且預后越差。可以通過常規檢測VEGF-C、VEGFR-3來幫助食管癌的早期診治和淋巴結轉移的判斷，評估食管癌患者的預后。