骨髓間充質干細胞經腎動脈移植對阿霉素慢性腎病大鼠腎臟炎癥的影響

李天祎， 楊 揚， 萬珊杉， 楊素萍， 李嘉琦， 王家平

慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）發生率近年來逐漸增高，我國約有成年患者1.2 億，患病率高達10.8%，患者經濟負擔也越來越重［1］。 多項研究表明腎臟免疫介導性炎癥是CKD 重要致病因素之一。 目前CKD 治療手段有限， 僅能延緩腎衰竭進展，達不到根治目的，尋找特異性治療方法成為亟待解決的問題［2］。 轉化醫學與再生醫學不斷興起，為治療提供了新思路。 骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）作為再生醫學源于中胚層的未分化成體干細胞，具有定向分化為成骨細胞、脂肪細胞等潛在能力，并可通過抑制氧化應激、減少細胞凋亡、促進新毛細血管形成和抑制炎性反應、刺激內源性再生等，減輕腎損傷并促進受損腎組織重構［3］。 目前，BMSC 主要通過尾靜脈和腎動脈移植，不同移植方法會對BMSC 歸巢數量產生影響，對腎組織修復效果也會產生差異。 本研究旨在評價經腎動脈移植BMSC，對阿霉素CKD大鼠受損腎臟的修復作用及對腎臟炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

37 只健康清潔級16 周齡雄性Sprague- Dawley（SD）大鼠（購自昆明醫科大學實驗動物中心），體質量250～300 g，其中2 只4 周齡，用于分離BMSC。胎牛血清（FBS）、低糖培養基（L- DMEM）購自美國Gibco 公司，阿霉素購自美國Sigma 公司，肝素由實驗室配置，蘇木精- 伊紅（HE）染色試劑盒、青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸（EDTA）消化液購自北京索萊寶科技公司，CD3、CD20 單體購自英國Abcam 公司。

1.2 BMSC 分離和培養

2 只4 周齡大鼠脫頸處死， 置于75%乙醇溶液中浸泡10 min，0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈， 于超凈臺下分離雙側脛骨和股骨，剪去兩側骨骺端，磷酸緩沖液（PBS）沖洗骨髓腔3～5 次，至其變白；將骨髓腔沖洗液置于離心管， 充分吹打混勻后用100 μm細胞篩過濾，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用含有10% FBS、1%青鏈霉素雙抗的L- DMEM 重懸細胞， 再次吹打均勻后制成單細胞懸液， 接種至T25細胞培養瓶中， 置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育；48 h 后首次換液并每間歇3 d 換液1 次；待細胞生長融合達75%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化細胞，按1︰4 傳代。 取P3 代細胞進行成骨、成脂誘導分化培養，流式細胞儀鑒定細胞表面抗原。

1.3 模型制作和分組

大鼠置于鼠籠，自由飲食飲水1 周。 取24 只制作CKD 動物模型： 全身麻醉后俯臥位固定于超凈臺，逐層切開左側肋脊角皮膚和肌肉，暴露左腎，結扎左腎蒂后切除左腎， 待大鼠自然清醒后以3 mg/kg阿霉素經尾靜脈注射，并于1 周后取同等劑量阿霉素再次注射，術后每周經眼內眥靜脈取血檢測腎功能。 參考陸發承等方法［4］，以血紅蛋白減少，血肌酐、尿素氮升高為造模成功標準。 造模過程中，3 只鼠因失血過多死亡，另隨機選取3 只造模后補充。 將造模成功大鼠隨機分為CKD 組、經腎動脈移植BMSC組（A 組）和經尾靜脈移植BMSC 組（V 組），每組8只；余8 只健康大鼠為正常對照組（N 組），經尾靜脈輸注等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4 不同途徑移植BMSC

將BMSC 用0.25%胰蛋白酶- EDTA 消化，含10%FBS L-DMEM 培養基終止消化后以1 500 r/min離心，棄上清液，PBS 重懸細胞，充分吹打混勻制成2×106個/mL 單細胞懸液，冰盒保存備用。 A 組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后仰臥固定，參考趙桂峰等［5］方法，選擇左頸部距頸正中線約0.5 cm 處， 聚維酮碘備皮消毒鋪巾后暴露頸部，于正中作一約2.0 cm 縱行切口； 逐層分離皮膚、肌肉組織，充分暴露視野，頓性分離左頸總動脈，眼科剪作T 形切口， 將無菌PE10 導管頭斜形剪切塑形后，DSA 動態觀察下向足側推送至右腎動脈開口處，同時間推注肝素；注射少量對比劑確定導管在腎動脈，推注500 μL BMSC 懸液，結扎左頸總動脈后逐層縫合手術切口；術后肌內注射抗生素預防感染，將大鼠置于保溫箱中密切觀察，待其自然清醒后歸籠繼續飼養。 V 組大鼠經尾靜脈注射等量BMSC 懸液。CKD 組經尾靜脈注射等量PBS 溶液。N組經尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 標本采集與檢測

觀察指標為血肌酐、 血尿素氮及24 h 尿蛋白，腎臟病理切片HE 染色觀察病理改變情況。 分別于移植BMSC 后7、14 d， 將各組大鼠放入代謝籠內，收集24 h 尿液，尾靜脈采血分離血清，Chemray 240全自動生化分析儀檢測24 h 尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平。 14 d 末處死各組大鼠，取腎組織，固定、脫水后制成5 μm 石蠟切片，HE 染色觀察腎臟病理形態學變化，免疫組化染色觀察CD3、CD20 浸潤情況。

1.6 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多變量重復測量資料用方差分析， 兩兩比較用最小顯著性差異（LSD）-t 驗檢，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

大鼠BMSC 分離、純化、鑒定結果顯示，倒置相差顯微鏡下BMSC 呈梭形， 魚群狀或旋渦狀貼壁生長；P4 代BMSC 表面抗原CD11b、CD45、CD29、CD90 表達率，分別為2.23%、1.94%、99.98%、99.97%，見圖1。

圖1 P4 代大鼠BMSC(×20)

N 組大鼠毛色光澤，精神良好；CKD 組、A 組、V組大鼠精神萎靡，毛色微黃，進食量、體質量減少，部分大鼠伴發腹水。 BMSC 移植治療結果顯示，CKD組、A 組、V 組與N 組相比，BMSC 移植后血肌酐、血尿素氮和24 h 尿蛋白均顯著升高（P＜0.01）。 移植后7、14 d，V 組、A 組血肌酐均較CKD 組降低（P＜0.01），A 組在7 d 時下降更為顯著（P＜0.01）；移植后7 d，V 組、A 組血尿素氮較CKD 組均顯著下降（P＜0.01），A 組變化更為顯著（P＜0.01），移植后14 d，V 組、A組較CKD 組稍降低，A 組變化更為顯著（P＜0.01）；移植后7、14 d，V 組、A 組24 h 尿蛋白較CKD 組均顯著降低（P＜0.01），A 組下降更為顯著（P＜0.01），見表1。

表1 BMSC 移植后各組大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h 尿蛋白比較

免疫組化觀察結果顯示，N 組大鼠CD3、CD20表達為陰性；CKD 組大鼠CD3 在大量腎小管上皮細胞和腎間質中呈強陽性或陽性表達，CD20 在腎間質中呈強陽性表達， 在部分腎小球中呈陽性表達；A 組、V 組大鼠腎間質CD3、CD20 表達較CKD組減輕，但A 組較V 組減輕更為明顯，見圖2。 大鼠腎臟病理結果顯示，N 組可見正常腎小球，腎小球血管襻薄而清晰， 周圍腎小管正常；CKD 組腎小球出現萎縮，硬化，局部腎小球毛細血管襻擴張淤血，腎小管結構紊亂， 部分上皮細胞可見空泡樣變性，腔內可見蛋白管型，且腎間質內大量炎性細胞浸潤；A組、V 組腎臟近曲、遠曲小管、髓襻和集合管上皮可見不同程度水腫變性，部分管腔擴張，腔內可見少量透明管型，部分腎小球有輕微萎縮，腎間質內可見少量輕- 中度淋巴細胞和漿細胞浸潤的炎性反應，A 組病理形態學變化較V 組更為輕微，見圖3。

圖2 各組大鼠CD3、CD20 免疫組化染色結果(×200)

圖3 各組大鼠腎組織HE 染色結果(×20)

3 討論

CKD 在臨床上主要表現為高血壓、水腫、血尿、蛋白尿等，并會對腎組織造成不可逆損傷。 隨著發病率逐年上升及治療手段局限性，CKD 成為增長最快、導致死亡的第三大慢性疾?。?-7］。 目前CKD 模型制作方法有很多， 例如5/6 腎臟切除＋阿霉素誘導法、單側輸尿管結扎法、腺嘌呤誘導法等。 本實驗采用較為公認的單側腎臟切除＋尾靜脈注射阿霉素法制作CKD 模型。 阿霉素常用于多種癌癥治療，對心臟、肝臟、骨髓、胃腸等有較強的不良反應，但經大鼠尾靜脈注射后，其不良反應主要累及腎臟［8］。 單側腎臟切除后，余腎代謝負荷加重，代償不足，再加上阿霉素不良反應，呈現出腎功能惡化，并在病理上表現為腎小球萎縮、硬化，球囊粘連，局部腎小球毛細血管襻擴張淤血等， 更加符合慢性腎衰竭表現。隨著對CKD 研究深入， 逐漸發現其發病與腎臟免疫介導炎癥密切相關。 有文獻報道，T 淋巴細胞和B淋巴細胞自身反應導致的免疫穩態破壞， 可能使CKD 炎性反應發生在不同部位［9-10］。 T 淋巴細胞介導的細胞免疫是促發腎小球和腎間質炎癥的主要原因， 可與樹突狀細胞相互作用并加重腎小管損傷，而CD3 是T 淋巴細胞特異性表面抗原，且在腎組織中表達程度與腎損害嚴重程度保持一致，一定程度上可作為評估腎臟損傷嚴重程度的指標。 此外，CKD 持續性炎性反應與B 淋巴細胞增殖有關，且有研究證明抗CD20 單克隆蛋白（利妥昔單抗）可啟動B 細胞免疫溶解過程， 靶向性殺傷B 細胞，阻斷其對腎組織的損傷［11］，這一結果證實CD20 可作為B 淋巴細胞特異性抗原參與CKD 炎性反應［12］。因此， 可通過觀察CD3、CD20 在腎組織中浸潤情況，判斷腎損傷嚴重程度。

近年來多項研究表明BMSC 具有修復損傷腎組織的能力，但具體修復機制仍不明確。Aghajani-Nargesi 等［13］研究顯示，BMSC 可通過與多種免疫細胞相互作用達到抑制炎性反應的目的。Lindoso 等［14］研究發現，BMSC 可過表達CXCR4 受體或絲氨酸蛋白酶激肽釋放酶改善腎功能，并增強腎損傷中抗炎作用。 多項研究證明上述結論，BMSC 具有改善腎小球濾過率、減輕細胞衰老和炎性反應并增加細胞增殖的作用［15］。 然而治療過程中如何提高BMSC 歸巢率和實驗動物存活率是亟待解決的問題。 白彝華等［16］經腎動脈移植BMSC 治療CKD 大鼠，結果發現腎動脈移植組24 h 尿蛋白和尿微量蛋白下降程度與尾靜脈移植組相比更為明顯，提示經腎動脈移植BMSC 對CKD 受損腎組織修復效果更佳。

本實驗通過對比腎動脈和尾靜脈兩種途徑移植BMSC 治療CKD 大鼠發現， 兩種途徑對受損腎組織均起到修復作用。 BMSC 移植后7 d，V 組、A 組與CKD 組相比，24 h 尿蛋白均顯著降低（P＜0.01），直至14 d 末A 組血肌酐、血尿素氮與V 組、CKD 組相比下降顯著（P＜0.01），證明BMSC 經腎動脈移植的效果優于經尾靜脈移植；免疫組化染色結果也顯示，CKD 組、A 組、V 組CD3、CD20 均呈強陽性表達，A 組表達較V 組減弱；此外，A 組、V 組炎性浸潤均較CKD 組減輕， 其中A 組腎小管和腎間質僅有少量炎性細胞浸潤，萎縮的腎小球數量減少，腎小管擴張情況得到改善。 綜合以上結果可得出結論，BMSC 可通過抑制炎性反應達到修復CKD 腎組織損傷的目的， 觀察時限內經腎動脈移植效果優于經尾靜脈移植。

總之，BMSC 通過抑制免疫介導性炎癥修復受損腎臟組織，觀察時限內經腎動脈途徑移植效果優于經尾靜脈途徑移植。 本實驗不足在于，未對炎性因子浸潤進行定量分析，BMSC 抑制腎臟炎癥的具體機制尚不明朗，而經腎動脈移植BMSC 修復受損腎組織的效果優于經尾靜脈移植的原因可能與BMSC 歸巢數量有關， 但BMSC 歸巢數未加檢測。BMSC 通過何種信號通路介導炎性反應及BMSC 歸巢的影響因素等，仍需進一步研究證實。