重組抗原免疫印跡法排查化學發(fā)光免疫分析法檢測梅毒螺旋體抗體假陽性的價值

王子瑜

天津市第二人民醫(yī)院感染科 （天津 300110）

梅毒血清學檢測是現(xiàn)階段臨床診斷梅毒的主要依據(jù)，隨著醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展，梅毒血清學檢測方法不斷進步[1]。以往梅毒血清學檢測采用活梅毒螺旋體進行轉(zhuǎn)種，而后用提純的特異性抗原蛋白進行免疫印跡分析及血清凝集試驗等，但該方法菌種保存及轉(zhuǎn)種成本均較高，且蛋白提純等步驟困難。近年來，臨床開始應(yīng)用基因工程抗原來進行梅毒血清學檢測，常見的檢測方法有多重免疫測定法、酶免疫試驗法、金磁微粒標記免疫層析法及化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）[2]，但臨床存在無梅毒病史患者、老年人或是腫瘤患者等采用上述方法檢測呈梅毒血清學陽性卻無法解釋的情況[3]。基于此，本研究分析重組抗原免疫印跡法（recombinant antigen western blotting，RAWB）排查CLIA 檢測梅毒螺旋體抗體假陽性的價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2020年8月于我院采用CLIA 得到的梅毒螺旋體抗體陽性的血清樣本66份，涉及患者64例（包含有明確二期梅毒臨床表現(xiàn)、高齡、病程和臨床癥狀不清晰患者及CLIA 檢測結(jié)果弱陽性患者），男26例，女38例；年齡21～89歲，其中21～50歲34例（第1組），51～70歲13例（第2組），71～89歲17例（第3組）；出現(xiàn)二期梅毒臨床癥狀的患者15例（在第1組內(nèi)），樣本17份（有2例為治療前后雙份血清）。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，入選患者均已簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 CLIA 檢測

采用干燥管抽取患者靜脈血5 ml，以3 500 r/min 離心5 min，分離血清待測；儀器選用Abbott I2000 全自動化學發(fā)光免疫分析儀，對其進行常規(guī)維護及保養(yǎng)，并對項目行質(zhì)控監(jiān)測，合格后方可進行標本檢測，即檢測梅毒螺旋體抗體，結(jié)果由儀器給出。結(jié)果判定：陽性，S/CO 值≥1；可疑陽性，S/CO 值≥0.8且<1；陰性，S/CO 值<0.8。

1.2.2 RAWB 檢測

采用重組抗原TP17、TP47、TP45及TP15等制備的NC膜檢測，檢測盒由康泰生物公司生產(chǎn)，最終以實驗NC 膜條質(zhì)控條帶和對應(yīng)抗原條帶顯色情況進行結(jié)果判定，具體為：陽性，質(zhì)控線顯色正常，至少2條抗原線顯色；可疑陽性，僅1條抗原線顯色；陰性，抗原線不顯色；無效，未見質(zhì)控線顯色或顯色明顯下降。

1.2.3 免疫印跡法（western blotting，WB）檢測

試劑盒由德國歐蒙公司生產(chǎn)，依據(jù)操作說明書的判斷標準對66份樣本進行確證試驗，并將WB 陽性結(jié)果作為真陽性，操作時，取出抗原膜條并將其放入反應(yīng)槽中，加入緩沖液后于室溫下溫育，再加入稀釋過的樣本，吸走槽中液體并清洗膜條3次后加入酶結(jié)合物，經(jīng)溫育、加入底物液等操作后，將膜條放于模板中，風干后進行分析。結(jié)果判定：陽性，IgG 于印跡膜出現(xiàn)針對分子量47、45、17及15 kDa 的多于1條多肽抗原條帶；可疑陽性，僅出現(xiàn)1條多肽抗原條帶；陰性，無多肽抗原條帶出現(xiàn)。

1.3 觀察指標

以WB 檢測結(jié)果為金標準，分析CLIA 檢測結(jié)果；比較CLIA、RAWB 及WB 檢測結(jié)果；比較不同年齡組患者的RAWB 與CLIA 檢測結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CLIA 檢測結(jié)果

CLIA 檢測第1組梅毒螺旋體抗體陽性率為94.44%（34/36），可疑陽性率為5.56%（2/36）；CLIA 檢測第2組梅毒螺旋體抗體陽性率為92.31%（12/13），可疑陽性率為7.69%（1/13）；CLIA 檢測第3組梅毒螺旋體抗體陽性率為82.35%（14/17），可疑陽性率為17.65%（3/17）。

2.2 CLIA、RAWB 及WB 檢測結(jié)果比較

CLIA 與RAWB 的檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.604，P<0.05）；CLIA 與WB 的檢測結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=16.500，P<0.05）；RAWB 與WB 的檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.524，P>0.05），見表1。

表1 CLIA、RAWB 及WB 檢測結(jié)果比較（份）

2.3 不同年齡組患者的RAWB 與CLIA 檢測結(jié)果比較

兩種方法檢測第1組的結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.727，P>0.05）；兩種方法檢測第2、3組的結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.500、7.771，P<0.05），見表2。

表2 不同年齡組患者的RAWB 與CLIA 檢測結(jié)果比較（份）

3 討論

臨床常依據(jù)臨床癥狀及實驗室檢查診斷梅毒，后者包括顯微鏡檢查、血清學檢測及聚合酶鏈式反應(yīng)等[4]。由于顯微鏡檢查及聚合酶鏈式反應(yīng)檢出結(jié)果易受實驗室條件和患者感染梅毒時間等因素的干擾，因此現(xiàn)階段較常用于梅毒的實驗室檢查為血清學檢測，其中篩查試驗包括梅毒反應(yīng)素試驗、甲苯胺紅不加熱血清試驗、滅活血清反應(yīng)素試驗等，確證試驗包括梅毒螺旋體顆粒凝集試驗、梅毒螺旋體血凝試驗、WB 和CLIA 等，但當患者為神經(jīng)梅毒、無癥狀先天梅毒或合并人類免疫缺陷病毒/艾滋病時，采用血清學檢測診斷較困難[5]。篩查試驗主要檢測被感染宿主早期細胞被破壞釋放出的磷脂類物質(zhì)及受刺激生成的免疫球蛋白G、免疫球蛋白M 等[6]，假陽性率較高，在老年患者或合并惡性腫瘤、各種急性傳染病等免疫系統(tǒng)異常的患者中較多見。確證試驗特異度高，但抗體滴度不能反映梅毒活動性，無法判斷梅毒病程[7]。

CLIA 采取混合重組抗原（TpN15、17及47）包被的微粒與被檢測樣本中梅毒螺旋體抗體結(jié)合，測定微粒表面梅毒螺旋體抗體所結(jié)合反應(yīng)物的相對光單位（relative light unit，RLU），樣本梅毒螺旋體抗體水平與RLU 成正比，比較RLU 與臨界值，若RLU 大于臨界值，則認為梅毒螺旋體抗體陽性；該方法效率高、成本低，已被廣泛用于臨床。WB 檢測是通過病毒特異性抗原有關(guān)試劑來檢測梅毒螺旋體抗體且其檢測靈敏度和特異度均較高，為梅毒特異性抗體確證試驗；考慮到目前抗原成分多為人工重組抗原制備，WB 檢測的假陽性率有所上升。本研究采取優(yōu)化改進的特異性病原體抗原蛋白來制作免疫印跡試劑，采用RAWB 法對66份樣本的檢測結(jié)果與采取病原體活體接種和提純抗原制備的結(jié)果一致，但RAWB、WB 與CLIA 檢測結(jié)果仍存在差異。臨床上部分老年人、腫瘤患者、卒中人群及孕婦常出現(xiàn)通過CLIA 檢測呈陽性卻無法合理解釋的情況。本研究主要選取CLIA 檢測梅毒螺旋體抗體陽性樣本，包含有明確二期梅毒臨床表現(xiàn)、高齡、病程和臨床癥狀不清晰患者及CLIA 檢測結(jié)果弱陽性患者的血清，用以排查其中的假陽性情況，結(jié)果顯示，RAWB 與CLIA 檢測結(jié)果存在明顯差異，分析CLIA 檢測中或存在假陽性情況。

綜上所述，CLIA 檢測梅毒螺旋體抗體存在一定的假陽性情況，RAWB 可幫助臨床排查假陽性結(jié)果，當患者CLIA檢測結(jié)果為弱陽性時，則需根據(jù)其個體特征綜合分析，必要時可通過RAWB 排查。