中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成的分子機(jī)制及其在膿毒癥中病理作用的研究進(jìn)展

鄭大勇，張?zhí)煲恚衷聪＃钫嬗瘢?，宗曉龍（通信作者）

1 天津醫(yī)科大學(xué)寶坻臨床學(xué)院 （天津 301800）； 2 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（天津 300211）； 3 天津心臟病學(xué)研究所 （天津 300211）； 4 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 （天津 300211）

2004年，Brinkmann 等[1]應(yīng)用佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激中性粒細(xì)胞后，觀察到一種釋放至胞外的DNA 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）。此后，眾多的刺激物如細(xì)菌、真菌、活化的血小板、免疫復(fù)合物（immune complex，IC）以及高遷移速率族蛋白（high mobility group box 1，HMGB1）等損傷相關(guān)模式分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）被陸續(xù)報(bào)道能夠誘導(dǎo)NETs 形成[2]。NETs 與膿毒癥存在密切聯(lián)系，一方面在膿毒癥進(jìn)程中病原相關(guān)模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和DAMPs 分子譜是誘導(dǎo)NETs 形成的潛在激活物[3-4]，另一方面NETs 通過(guò)多種途徑參與膿毒癥發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究提示NETs 是治療膿毒癥患者及其相關(guān)器官功能障礙的潛在靶點(diǎn)[5]。現(xiàn)對(duì)NETs 形成的分子機(jī)制及其在膿毒癥中病理作用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 NETs 形成的分子機(jī)制

1.1 NETs 形成的上游調(diào)控

天然免疫是機(jī)體抵御感染的第一道防線，中性粒細(xì)胞是人體內(nèi)數(shù)量最多的先天免疫細(xì)胞，其主要通過(guò)吞噬或釋放NETs 的方式清除病原微生物[6]。雖然吞噬與釋放NETs 都能實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的捕殺，但兩者的免疫效應(yīng)機(jī)制截然不同。吞噬過(guò)程依賴于細(xì)胞骨架完整，而NETs 形成伴隨著細(xì)胞骨架破壞。此外，吞噬過(guò)程將髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）和吞噬底物共同包被于吞噬小體，以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的殺滅，而MPO、NE由胞漿入核驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)解聚是NETs 形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7]。

面對(duì)病原微生物入侵，中性粒細(xì)胞在吞噬與釋放NETs 之間做出何種響應(yīng)，以及調(diào)控這種選擇的機(jī)制尚不明確。Branzk 等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，病原體體積是影響這一過(guò)程的重要因素，中性粒細(xì)胞感受體積較大的病原體（如真菌菌絲）刺激后傾向于釋放NETs，而對(duì)于細(xì)菌和酵母等小體積病原體則優(yōu)先啟動(dòng)吞噬作用；進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞模式識(shí)別受體樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C 型凝集素受體-1（dendritic cell-associated C-type lectin-1，Dectin-1）在介導(dǎo)吞噬作用的同時(shí)能夠抑制NE 入核，敲低Dectin-1后NETs 生成水平顯著上調(diào)。膿毒癥免疫失調(diào)在細(xì)胞水平表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞減少和未成熟中性粒細(xì)胞增多[9]。Taneja 等[10]發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者外周血未成熟中性粒細(xì)胞吞噬功能和鈣通道受損，而Ca2+內(nèi)流在NETs 形成中發(fā)揮重要作用，因此，推測(cè)未成熟中性粒細(xì)胞傾向于優(yōu)先形成NETs。與之類似，Abrams 等[11]最近通過(guò)體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者中性粒細(xì)胞形成NETs 水平高于對(duì)照組，且NETs 生成水平與彌散性血管內(nèi)凝血發(fā)生率和全因死亡率相關(guān)。

1.2 NETs 形成的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)

NETs 形成過(guò)程涉及胞內(nèi)一系列分子事件，其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）發(fā)揮核心作用。中性粒細(xì)胞感受內(nèi)外源刺激后，以NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）依賴或NOX 非依賴的方式產(chǎn)生ROS 蓄積于胞漿，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重排[7]，同時(shí)破壞核膜與顆粒膜的完整性；顆粒酶MPO、NE 釋放并入核，導(dǎo)致組蛋白水解、染色質(zhì)解聚，肽酰基精氨酸脫亞胺酶4（protein-arginine deiminase type 4，PAD4）修飾組蛋白瓜氨酸化協(xié)同參與染色質(zhì)解聚[12]；最終，在NE 和消皮素D（gasdermin D，GSDMD）作用下細(xì)胞膜破裂[13]，染色質(zhì)與胞漿顆粒酶外排并通過(guò)靜電力聚集于胞外，形成具有殺菌活性的NETs（見(jiàn)圖1）。

圖1 NETs 形成的分子機(jī)制

NOX 依賴的NETs 形成途徑是最早被發(fā)現(xiàn)且研究較為完善的通路，PMA、細(xì)菌、LPS、真菌、活化血小板、IL-8、IC 等眾多刺激物均能經(jīng)NOX 途徑誘導(dǎo)NETs 形成。NOX 活化釋放ROS 是該途徑的核心環(huán)節(jié)，但不同刺激物激活NOX 的上游機(jī)制有所不同。PMA 經(jīng)纖維肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma，Raf）/絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào) 節(jié) 激 酶（mitogen-activated extracellular signal regulatedkinase，MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路激活NOX[14]，而LPS 激活NOX 依賴Toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）和c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的參與[15]。

NOX 非依賴的NETs 形成途徑是近年發(fā)現(xiàn)的一種以線粒體釋放ROS 為核心的全新機(jī)制，該過(guò)程中線粒體代替NOX 提供ROS 來(lái)源[16]。Ca2+通道與NOX 非依賴的NETs 形成密切相關(guān)，離子霉素作為Ca2+載體能夠以NOX 非依賴性的方式誘導(dǎo)NETs 形成[16]。同時(shí)，PAD4誘導(dǎo)組蛋白瓜氨酸化、驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)解聚是NOX 非依賴途徑的必需環(huán)節(jié)[16]。

目前并不清楚在體內(nèi)病生理?xiàng)l件下，中性粒細(xì)胞主要通過(guò)上述哪種途徑釋放NETs，抑或兩者協(xié)同介導(dǎo)NETs 形成。Lood 等[17]的研究中通過(guò)通路抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中性粒細(xì)胞在IC 刺激下，單純激活NOX 不足以啟動(dòng)NETs 釋放，而激活線粒體釋放ROS 能夠顯著提高NETs 水平，表明線粒體源ROS 在某些情況下是NETs 形成所必需的。后續(xù)研究應(yīng)加強(qiáng)對(duì)特定病理?xiàng)l件下NETs 形成機(jī)制的解析，這不僅有助于理解不同NETs 形成機(jī)制的病理生理意義，還有助于指導(dǎo)精確靶向NETs 治療。

1.3 NETs 釋放與細(xì)胞命運(yùn)結(jié)局

早期研究認(rèn)為NETs 是中性粒細(xì)胞“自殺式”的免疫應(yīng)答，在細(xì)胞壞死后幾個(gè)小時(shí)，隨著核膜和漿膜破裂，染色質(zhì)DNA 以云霧狀釋放至胞外形成NETs[18]。后續(xù)研究進(jìn)一步在分子水平建立了NETs 與細(xì)胞死亡的聯(lián)系。受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）、RIPK3和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL）是介導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡的關(guān)鍵原件，Schreiber 等[19]和Desai 等[20]發(fā)現(xiàn)PMA、尿酸結(jié)晶和抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體能夠以RIPK1/3-MLKL 信號(hào)依賴的方式誘導(dǎo)NETs 形成，但同時(shí)有研究指出敲除RIPK3基因或藥物抑制MLKL 雖然能夠抑制壞死性凋亡，但并不影響NETs 釋放[21]。最近Amini 等[22]發(fā)現(xiàn)，PMA 刺激中性粒細(xì)胞幾分鐘后線粒體DNA 即可釋放，而延長(zhǎng)刺激時(shí)間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，提示NETs 形成與細(xì)胞死亡是不同機(jī)制驅(qū)動(dòng)的不同過(guò)程。

實(shí)際上，已有多項(xiàng)研究報(bào)道細(xì)胞死亡并不是中性粒細(xì)胞釋放NETs 后的唯一結(jié)局[23-25]。2009年，Yousefi 等[23]發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞經(jīng)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和LPS 或補(bǔ)體C5a 刺激后能夠釋放線粒體DNA 形成NETs，但其生命周期并未改變。2010年，Pilsczek 等[24]發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的殺白細(xì)胞毒素能夠誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞細(xì)胞核形成小泡，這些小泡釋放至胞外形成NETs，此過(guò)程進(jìn)展迅速且不依賴NOX 激活和細(xì)胞膜破裂。2012年，Yipp 等[25]觀察到中性粒細(xì)胞釋放NETs 后仍保有趨化和吞噬能力。以上報(bào)道提示NETs 形成和細(xì)胞死亡是不同機(jī)制調(diào)控的兩種不同的細(xì)胞活動(dòng)。

2 NETs 的體內(nèi)清除

NETs 具有清除感染的作用，而過(guò)量的NETs 蓄積會(huì)導(dǎo)致組織損傷，因此，NETs 的及時(shí)清除對(duì)于維持組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）和巨噬細(xì)胞在NETs 清除過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DNase Ⅰ能夠水解DNA 骨架，將網(wǎng)狀NETs 降解為巨噬細(xì)胞能夠吞噬的碎片底物[26]。DNase Ⅰ活性受限或巨噬細(xì)胞吞噬能力降低，體內(nèi)NETs 蓄積，已被證明與狼瘡性腎病、膿毒癥性血栓以及急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratry distress syndrme，ARDS）密切相關(guān)，應(yīng)用人工重組DNase 或重塑巨噬細(xì)胞對(duì)NETs 的吞噬能力，為這些疾病的治療提供了全新思路[27-28]。

3 NETs 在膿毒癥中的病理作用

盡管驅(qū)動(dòng)NETs 形成的機(jī)制是多樣的，其伴隨的細(xì)胞結(jié)局也不盡相同，但NETs 的化學(xué)本質(zhì)均是以DNA 為骨架，粘附有多種顆粒蛋白的網(wǎng)狀復(fù)合物。NETs 組份的多樣性為其發(fā)揮殺菌作用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為其產(chǎn)生廣泛的病理作用埋下了隱患。

3.1 調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)

動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠NETs 水平上調(diào)，注射重組人脫氧核糖核酸酶（recombinant human deoxyribonuclease，rhDNase）加速NETs 降解，能夠降低趨化因子、IL-6、HMGB1水平，減少組織損傷和病死率[29]。NETs 的促炎機(jī)制可以是直接的，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞間接實(shí)現(xiàn)。NETs 組份DNA 和組蛋白能夠作為DAMPs 分子，直接啟動(dòng)或放大炎癥反應(yīng)[3]。Warnatsch 等[30]發(fā)現(xiàn)NETs 經(jīng)TLR2或TLR4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6和pro-IL-1β 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，加速動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。與之類似，國(guó)內(nèi)Song 等[31]最近發(fā)現(xiàn)NETs 能夠誘導(dǎo)肺組織巨噬細(xì)胞向促炎的M1型極化，從而加重肺損傷。同時(shí)，Schauer 等[32]發(fā)現(xiàn)NETs 粘附的水解蛋白酶能夠降解細(xì)胞因子和趨化因子，從而緩解局部炎癥[32]。這種局部抗炎作用在膿毒癥系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)中是否同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用，有待進(jìn)一步探討。

3.2 誘發(fā)凝血功能紊亂

凝血功能紊亂是膿毒癥的典型病理特征，NETs 的促栓機(jī)制是多樣的[33]。首先，NETs 巨大的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為其發(fā)揮血管占位作用提供了先天條件；其次，NETs 成份組蛋白H3/H4能夠經(jīng)接觸途徑激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及組織因子依賴的凝血酶生成，同時(shí)NE 和MPO 抑制抗凝蛋白組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）；此外，NETs 可以激活血小板，形成血小板與中性粒細(xì)胞交互作用的正反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[34]。

血小板與中性粒細(xì)胞協(xié)同作用誘導(dǎo)NETs 形成已被證實(shí)與血栓、自身免疫病、腫瘤等多種疾病密切相關(guān)[35]。血小板和中性粒細(xì)胞在外周循環(huán)中數(shù)量豐富，膿毒癥肺損傷時(shí)兩者共同聚集于肺組織[36]，為兩者相互作用提供了空間條件，而血小板本身能夠作為調(diào)控NETs 形成的上游元件[37]。肝素/低分子肝素是ICU 最常用的預(yù)防性抗栓藥物，肝素誘導(dǎo)性血小板減少癥（heparin induced thrombocytopenia，HIT）是困擾臨床的藥物不良反應(yīng)。既往認(rèn)為HIT 是IC 介導(dǎo)的血小板消耗性減低伴發(fā)血栓并發(fā)癥。新近一項(xiàng)關(guān)于NETs 與HIT的研究帶來(lái)了HIT 概念上的突破，該研究發(fā)現(xiàn)，NETs 是HIT 伴發(fā)血栓形成的關(guān)鍵因素，且NETs 的這種促栓作用并不完全依賴于血小板的參與[38]。

3.3 介導(dǎo)組織損傷

NETs 具有細(xì)胞毒性，在體外能夠直接殺傷內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，體內(nèi)過(guò)量的NETs 蓄積導(dǎo)致上皮組織和內(nèi)皮組織損傷[39]。組蛋白通過(guò)破壞細(xì)胞膜發(fā)揮細(xì)胞毒作用[40]，其他NETs 成份如防御素和NE 能夠水解細(xì)胞間基質(zhì)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞間連接破壞[41]。肺血管內(nèi)皮屏障損傷是ARDS 的核心發(fā)病機(jī)制，血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘連蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）是構(gòu)成肺血管內(nèi)皮粘附連接的核心蛋白，血清VE-cadherin 水平對(duì)膿毒癥ARDS 具有預(yù)測(cè)價(jià)值和預(yù)后意義[42]。已經(jīng)有研究建立了NETs 上調(diào)與VEcadherin 分子重排的聯(lián)系[43]，后續(xù)研究應(yīng)深入對(duì)該過(guò)程調(diào)控機(jī)制以及潛在干預(yù)靶點(diǎn)的探討。

4 靶向NETs 治療膿毒癥

隨著臨床前研究證據(jù)的積累，NETs 有望成為治療膿毒癥的全新靶點(diǎn)。總的來(lái)說(shuō)，靶向NETs 策略可分為抑制NETs 形成、加速NETs 降解以及拮抗NETs 毒性成份3方面。

DNase 是一類能夠消化DNA 的核酸內(nèi)切酶，體內(nèi)DNase Ⅰ和DNase Ⅲ是降解NETs 的重要成份[28]，人工重組DNase Ⅰ已被臨床用于治療囊性纖維化。DNase 能夠降解NETs 的DNA 骨架，動(dòng)物水平研究顯示，注射rhDNase 能夠改善肺損傷，降低病死率[44]。國(guó)內(nèi)Li 等[45]發(fā)現(xiàn)，抗瓜氨酸化組蛋白H3抗體能夠提高盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（cecal ligation and peferation，CLP）模型小鼠的生存率。NE 是強(qiáng)效的蛋白水解酶，應(yīng)用NE 抑制劑能夠降低膿毒癥腎損傷風(fēng)險(xiǎn)[46]。

循環(huán)DNA 和組蛋白不僅來(lái)源于NETs，也可能源自壞死的組織細(xì)胞，因此，靶向抑制NETs 形成的上游環(huán)節(jié)是更加特異的策略。PAD4在驅(qū)動(dòng)染色質(zhì)解聚環(huán)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，PAD4脫氨活性抑制劑（Cl-amidine）能夠特異性抑制PAD4的活性。膿毒癥造模前預(yù)注射Cl-Amidine 能夠抑制體內(nèi)H3瓜氨酸化和NETs 水平，提高模型動(dòng)物生存率[47]。重要的是，Martinod 等[48]發(fā)現(xiàn)敲除PAD4基因在抑制NETs 形成的同時(shí)并不影響CLP 模型小鼠體內(nèi)細(xì)菌荷載量增加，提示PAD4可能是比較安全的干預(yù)靶點(diǎn)。

5 總結(jié)與展望

NETs 是中性粒細(xì)胞發(fā)揮免疫防御功能的重要方式，而過(guò)量的NETs 會(huì)產(chǎn)生廣泛的病理作用。NETs 的形成機(jī)制復(fù)雜多樣，NETs 組份中DNA 的來(lái)源、NETs 與細(xì)胞死亡的聯(lián)系和區(qū)別、不同NETs 形成機(jī)制在生理病理?xiàng)l件下如何調(diào)控并發(fā)揮作用等問(wèn)題，有待后續(xù)研究闡明。NETs 參與膿毒癥及其相關(guān)器官功能障礙的發(fā)病機(jī)制，靶向NETs 是治療膿毒癥的潛在策略。然而，在膿毒癥復(fù)雜病理?xiàng)l件下，驅(qū)動(dòng)NETs 形成的關(guān)鍵上游機(jī)制仍不明確，加之NETs 本身具有清除感染和局部抗炎的作用，因此，干預(yù)靶點(diǎn)以及干預(yù)時(shí)機(jī)的選擇和評(píng)價(jià)，是實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)向臨床轉(zhuǎn)化前需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。