去鐵胺通過抑制氧化應激反應促進小鼠深部組織壓力性損傷創面愈合*

張子銳， 張亞萍， 郭景琳， 山 慧， 張 菊△

（1青島大學護理學院，山東青島 260001；2山東大學第二附院醫院，山東濟南 250000）

隨著社會發展及人口老齡化現象日益凸顯，慢性傷口已經成為危害公共健康的主要疾病，包括壓力性損傷、下肢動靜脈潰瘍和糖尿病足潰瘍等［1］，其中，壓力性損傷又稱壓瘡、褥瘡，其醫療成本消耗在國內位居第3 位。深部組織壓力性損傷（deep tissue pressure injury，DTPI）是一類嚴重的壓力性損傷，因難愈合、進展快和易復發成為防治的重點和難點［2-3］，是臨床醫護工作中亟需解決的難題。

壓力性損傷是由壓力因素為主導驅動的局部微循環紊亂和重復缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。I/R 損傷引起局部組織血管內皮損傷、炎癥反應及氧化應激，產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［4-5］。在諸多I/R 損傷性疾病中存在鐵超載［6-7］。鐵是一種對細胞和生物體至關重要的基本微量元素，具有獨特的電化學性質，過量的游離鐵會引起氧化應激，與多種代謝性疾病、腫瘤和慢性傷口的發病機制密切相關［8］。去鐵胺（deferoxamine，DFO）是美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的一種小分子鐵絡合劑，對游離鐵離子具有高度的穩定性、特異性和選擇性［9］。研究顯示，局部使用DFO 可有效地抑制ROS的產生，具有抗氧化作用［10］。此外，DFO 可誘導慢性低氧環境中低氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的穩定表達，并刺激新生毛細血管再生，促進傷口愈合［11］。

基于此，本研究擬通過構建小鼠DTPI 模型，探討DTPI 中鐵離子的含量，以及DFO 的治療效果和作用機制，為治療慢性傷口提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠，體重（20±2）g，6～8 周齡，購自華富康生物科技有限公司（北京）。所有動物實驗經青島大學附屬醫院醫學實驗動物倫理委員會批準（QYFY WZLL 25887），實驗動物許可證號為SCXK（魯）2019-0003。人永生化角質形成細胞（human immortalized keratinocytes）HaCaT 由協和醫學院藥物所惠贈。

2 主要試劑

DFO 購 于Sigma-Aldrich；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購于美侖生物科技（大連）有限公司；ROS 檢測試劑盒（WLA070a）購自萬類生物科技（沈陽）有限公司；蘇木精購自索萊寶科技（北京）有限公司；曙紅Y（醇溶性）購自生工生物工程（上海）有限公司；普魯士藍染色試劑盒購于索萊寶科技（北京）有限公司；Masson 三色染色試劑盒購于雷根生物技術（北京）有限公司；Taq PCR Master Mix 試劑盒購于百泰克生物科技（北京）有限公司；鼠抗HIF-1α 抗體、鼠抗血管內皮生長因子α（vascular endothelial growth factor-α，VEGF-α）抗體、鼠抗基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）抗體和鼠抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體均購于萬類生物科技（沈陽）有限公司；山羊抗鼠IgG Ⅱ抗（Proteintech）。

3 主要儀器

BX53 正置顯微鏡購自Olympus；熒光定量PCR儀購自BIONEER；ELx 800 全自動酶標儀購自BioTek。

4 主要方法

4.1 CCK-8 法檢測HaCaT 細胞活力 將培養的處于對數生長期的HaCaT 細胞株接種于96 孔板中（每孔5×103個），每組設6個復孔，細胞貼壁24 h后，每孔加入100 μL 含不同藥物的培養液，分別于24 h，48 h和72 h 棄去含藥培養液，每孔加入含有10% CCK-8的DMEM 培養液，37 ℃恒溫培養箱避光孵育30 min，置于酶標儀450 nm處讀取吸度光（A）值。

4.2 HaCaT 細胞內ROS 的含量 將HaCaT 細胞以每孔6×104個的密度接種于96 孔板24 h。分別加入不同濃度（100 μmol/L、500 μmol/L 和1 mmol/L）DFO預處理1 h 或2 h，然后加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗3 次，滴加ROS 探針反應液，37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗，封片，最后，使用熒光顯微鏡（BX53，OLUMPUS）觀察熒光，最大激發波長為485 nm，發射光譜為525 nm。

4.3 DTPI 模型的構建與分組 選用C57BL/6 雄性小鼠，根據文獻［12-14］，去除其背部和腹部毛發，在坐骨棘突的背部和腹部兩側各使用磁鐵（直徑12 mm，厚度5 mm，質量2.4 g，表面磁通密度1 000 Gs）施加壓力12 h，之后將磁鐵卸下，緩沖12 h。在施加壓力期間，小鼠進食正常，行動自由。將小鼠隨機分為假手術（sham）組、模型（model）組、DFO 低濃度（2 g/L）組和DFO高濃度（20 g/L）組，每組6只小鼠。DTPI模型建立完成后第1、3、5、7、9、11 和13 天分別皮下注射給藥，每天1次。

4.4 電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）檢測DTPI 肌肉組織中鐵含量 頸椎脫臼處死小鼠后，取20 mg小鼠肌肉組織至25 mL 消解容器中，加入8 mL 王水和2 mL H2O2水，使用石墨加熱板120～200 ℃消解60 min至樣品完全消解，冷卻至室溫，取出，置于電熱消解器中去除多余氮氧化合物，冷卻后過濾定容至10 mL 量瓶中。使用ICP-MS檢測勻漿組織中鐵離子的含量。4.5 普魯士藍染色 分別在第1 和7 天取材，將皮膚肌肉組織標本置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h。梯度乙醇脫水：將沖洗后的標本分別置于75%、85%、95%及100%乙醇中24 h。使用純二甲苯透明，總時間不超過4 h。過濾包埋：棄二甲苯，石蠟包埋，組織切片機切片，厚度為5 μm，使用普魯士藍染色后將切片置于37 ℃蒸餾水浸泡5 min，洗去表面結晶物質（白色沉淀物）后行HE 染色。最后封片，鏡檢。400倍顯微鏡下觀察，每張切片用隨機數字表法取5個不重疊視野，用Image Pro Plus 6.0軟件計算其平均吸光度值，進行分析。

4.6 創面收縮率 在損傷后的0～14 d中，相同條件下使用數碼相機拍攝局部傷口，將第3 天傷口面積設置為1（設為參考點），記錄不同時點的傷口面積，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件按下列公式計算傷口收縮率。傷口收縮率（%）=（第3 天傷口面積-特定時點傷口面積）/第3 天傷口面積×100%。若傷口收縮率為負值，表明傷口面積增加；若傷口收縮率為正值，表明傷口面積減小。

4.7 HE 染色和Masson 染色 取創面組織（1.5 cm×1.5 cm），4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯使其透明，石蠟包埋組織，切片厚度為5 μm，染色，脫水，透明，封片后，顯微鏡觀察HE 染色和Masson染色組織切片。每張切片用隨機數字表法取5個不重疊視野，用Image-Pro Plus 6.0 軟件計算其平均吸光度值，進行分析。

4.8 免疫組化染色 取創面組織于4%多聚甲醛中固定，于70%乙醇中梯度脫水，石蠟包埋，使用石蠟塊切片機（RM2235）切成5 μm 厚切片。用CD31 抗體染色（稀釋1∶500）進行免疫組化分析。最后，使用DP73顯微攝影成像系統（OLUMPUS）采集圖像數據。4.9 Western blot 按照標準的實驗室規程提取總蛋白。行8%～12%SDS-PAGE分離蛋白，然后轉移到硝酸纖維素膜上。Ⅰ抗分別為抗VEGF-α（稀釋比1∶100）、HIF-1α（稀釋比1∶100）、SDF-1（稀釋比1∶500）、TNF-α（稀釋比1∶500）和β-actin（稀釋比1∶100）抗體，Ⅱ抗為山羊抗兔IgG-HRP（稀釋比1∶5 000），使用Western blot 檢測軟件（Gel-Pro Analyzer）檢測蛋白表達。

5 統計學處理

統計分析采用SPSS 25.0統計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析和Tukey 檢驗，使用GraphPad Prism 5.0 軟件對平均值進行比較。重復測量數據用均數±標準差（mean±SD）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 DTPI肌肉組織中鐵離子含量增高

采用ICP-MS檢測DTPI肌肉組織中鐵離子含量，ICP-MS測量的標準品和測試樣品的質譜圖及結果顯示，正常組鐵離子含量為（41.57±4.48）mg/L。在傷口形成第1天時，模型組和DFO（20 g/L）組鐵離子含量分別為（63.21±4.48）mg/L和（48.83±2.89）mg/L；第7天時，模型組和DFO（20 g/L）組鐵離子含量分別為（88.91±2.81）mg/L和（52.20±3.61）mg/L，模型組肌肉組織中鐵離子含量較正常組顯著升高（P＜0.01），DFO（20 g/L）組鐵離子含量相比模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1A、表1。普魯士藍染色結果顯示，藍色區域集中于模型組的肌肉區，真皮和表皮內少見，在第1 天時，模型組與DFO（20 g/L）組均無明顯鐵沉積現象；第7 天時，模型組出現了明顯的鐵沉積現象；相反，DFO（20 g/L）組中鐵沉積數量較模型組有顯著減少，見圖1B。

表1 小鼠DTPI肌肉組織鐵含量測定Table 1. Determination of iron content in mouse muscle tissues（mg/L. Mean±SD. n=6）

Figure 1. Mass spectra of standard samples（upper left in A）and test samples（lower left in A），the standard curve（right in A），and local iron deposition（B）in muscle tissues of C57BL/6 mice on day 1 and day 7（Prussian blue staining，scale bar=500 or 100 μm）. Iron ion"accumulation"phenomenon was obviously observed in model group.圖1 標準品和檢測樣品的質譜圖、標準曲線及普魯士藍染色評估局部鐵沉積

2 DFO對HaCaT細胞無顯著毒性

CCK-8實驗結果表明，不同濃度的DFO對HaCaT細胞活力均無顯著影響，細胞狀態良好，見表2。

表2 CCK-8法檢測不同濃度DFO對HaCaT細胞活力的影響Table 2. The effects of different concentrations of DFO on viability of HaCaT cells were detected by CCK-8 assay（Mean±SD. n=6）

3 DFO抑制HaCaT細胞中ROS的產生

紅色的熒光強度代表的是HaCaT 細胞內ROS的含量。結果表明DFO 可顯著抑制HaCaT 細胞內ROS的產生，紅色熒光強度的減弱證明了這一點，見圖2A。不同濃度DFO 預處理1 h 和2 h 后，結果顯示相比于模型組，DFO 對HaCaT 細胞內ROS 的生成具有顯著抑制作用（P＜0.01），且具有濃度依賴性，其中1 000 μmol/L的DFO抑制效果最好，見圖2B。

Figure 2. Inhibitory effect of DFO on ROS production in HaCaT cells. Red fluorescence intensity represents the ROS level in HaCaT cells. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.圖2 DFO抑制HaCaT細胞內ROS的產生

4 DFO促進DTPI傷口愈合

DFO 組創面愈合速度與模型組相比顯著加快。在創面早期，DFO 組的創面初始面積小于對照組；第7 天，模型組的創面面積為（106±1.25）%，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組的創面面積分別為（69.0±2.45）%和（77.3±2.62）%，DFO組較模型組創面面積顯著降低（P＜0.05）；第14 天，模型組愈合面積為（73.0±1.25）%，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組的創面面積分別為（45.0±1.60）%和（39.0±1.20）%。結果表明，DFO 組在14 d 內傷口愈合率達到約60%以上，然而，模型組在14 d 內未完全愈合，傷口愈合率為（28.0±1.25）%。見圖3。

Figure 3. Wound healing after DTPI in C57BL/6 mice. The representative pictures of the three groups record the healing process at different time points. Each image is a square with an actual distance of 1.5 cm. Wound healing results were presented as the percentages of initial area. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs model group.圖3 C57BL/6小鼠DTPI后的傷口愈合情況

組織學結果顯示，第7 天，DFO 組中真皮層內的炎癥細胞較模型組相比顯著減少，可見新血管生成，而模型組未見明顯的新生血管；第14 天，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組創面表皮變薄，真皮增厚，有少量的毛囊，膠原沉積明顯及相對規則的細胞排列，與正常皮膚結構相似，不同濃度藥物組之間沒有顯著差異；模型組表皮增厚，真皮變薄，皮膚附屬器再生不良，細胞排列不規則、膠原沉積不明顯，見圖4。

Figure 4. Histomorphological assessment was performed on days 7 and 14 after DTPI in the mice. A：images of HE staining on days 7 and 14（scale bar=500 or 100 μm）；B：on days 7 and 14，amount of angiogenesis，degree of epithelialization，inflammatory cell infiltration and skin appendages were assessed；C：images of Masson′s trichrome staining on days 7 and 14，and quantitative analysis of collagen deposition（scale bar=500 μm）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs model group.圖4 DTPI后第7和14天時小鼠的組織形態學評估

免疫組化染色結果顯示，第7 天，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組的CD31 陽性表達率為（6.3±1.24）%和（8.0±0.81）%，模型組的CD31陽性表達率為（2.7±0.47）%（P＜0.01）；第14 天時，DFO（2 g/L）組、DFO（20 g/L）組與模型組的CD31 陽性表達率分別為（9.0±0.84）%、（10.0±0.82）%和（4.3±0.47）%（P＜0.01），藥物組之間沒有顯著差異，見圖5。

Figure 5. CD31 expression level was assessed by immunohistochemical staining on day 7 and 14 after DTPI. The scale bar=500 μm. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs model group.圖5 免疫組化染色評估DTPI后第7和14天的CD31表達水平

5 傷口愈合相關蛋白的表達分析

Western blot 結果顯示DFO 可調節愈合組織中相關蛋白（HIF-1α、VEGF-α、SDF-1 和TNF-α）的表達。第14 天，DFO 組肌肉組織中HIF-1α 和SDF-1 蛋白表達水平顯著高于模型組（P＜0.01），其中20 g/L DFO 組表達最高，DFO（20 g/L）組較DFO（2 g/L）組表達具有統計學差異（P＜0.05）；此外，DFO（20 g/L）組中TNF-α 蛋白的表達水平顯著低于模型組和DFO（2 g/L）組（P＜0.01）；DFO 組中VEGF-α 蛋白水平表達較模型組具有顯著升高（P＜0.01），見圖6。

Figure 6. Relative protein expression of HIF-1α，TNF-α，VEGF-α and SDF-1 after DTPI was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs model group.圖6 小鼠DTPI后創面組織中HIF-1α、TNF-α、VEGF-α和SDF-1的蛋白表達

討 論

本研究顯示小鼠DTPI 肌肉組織中鐵離子沉積異常，而局部應用DFO 可有效地加速傷口愈合并提高愈合質量。DTPI 主要由I/R 損傷引起局部組織內皮血管損傷，紅細胞內血紅蛋白鐵離子“障室封閉”系統瓦解，可螯合狀態的鐵離子水平升高［15-16］。活性鐵離子通過驅動Fenton 型Haber-Weiss 化學反應誘導泛化炎癥反應和氧化應激產生大量的ROS，加重氧化應激［17］。

鐵貯存于肌肉組織中，檢測DTPI 肌肉組織的鐵貯備水平，可直接反映DTPI 后有無鐵蓄積。本研究結果顯示DTPI 肌肉組織中鐵離子含量增高，促使傷口呈現一種過度的氧化應激反應，刺激細胞內不斷生成ROS，且HIF-1α 的表達隨著ROS 的增加而降低。體外細胞實驗也證實DFO 能下調HaCaT 中ROS的含量，通過減輕氧化應激反應，促進組織愈合。

創傷愈合是多種細胞、細胞因子和生長因子相互作用的過程，其改變會導致愈合過程的延遲［18-19］。缺氧可誘導細胞因子的產生，刺激成纖維細胞和角質形成細胞的增殖和遷移，局部缺氧可穩定HIF-1α，促進創面愈合［20］。DFO在缺氧條件下能誘導HIF-1α的積累，提高老年小鼠缺血皮瓣的存活，加速新生血管的形成。同樣，Bonham 等［21］也證實了局部注射DFO 能夠促進老年壓力潰瘍的愈合。本研究結果表明，DFO 組傷口愈合率較模型組顯著增加，至第14天創面幾乎完全愈合。通過分子生物學方法分析顯示，DFO 上調HIF-1α 和VEGF-α 蛋白的表達，與文獻報道的DFO 可穩定HIF-1α 表達是一致的，VEGF-α是其調控細胞因子之一［21］。另外，HIF-1α 也能激活SDF-1 的表達［22］。SDF-1 可激活/調節特定整合素分子來調節骨髓造血祖細胞的黏附/趨化能力，動員和招募血管前體細胞的歸巢信號，在血管生成中發揮重要作用［23］。同時，本研究顯示，DFO 治療組的TNF-α 蛋白表達與模型組相比顯著下降。TNF-α 被認為是傷口愈合過程中的促炎癥細胞因子，參與啟動早期傷口愈合反應［24-25］，提示DFO 可能通過下調TNF-α 表達，抑制炎癥反應，在組織修復中發揮積極作用。此外，經過DFO 治療后，HE 染色和Masson 染色結果表明小鼠傷口中膠原沉積均勻且致密。這些結果說明DFO 能有效促進小鼠DTPI 創面愈合，可能與HIF-1α激活的信號通路有關。

綜上所述，小鼠DTPI 肌肉組織中鐵離子異常分布，DFO 可抑制鐵離子引起的氧化應激損傷，通過調節HIF-1α/VEGF信號通路參與傷口愈合。