多重PCR檢測在腸道致病菌檢測中的作用

饒小惠

（大埔縣人民醫院，廣東 梅州 514229）

感染性腹瀉是臨床常見的腹瀉類型，具有較高的發病率與流行性，其中沙門菌和志賀菌是感染性腹瀉發生的重要腸道致病菌[1]。臨床發現，及時確定腸道致病菌類型對于疾病治療和康復具有重要的臨床意義。目前臨床對于腹瀉患者多采用常規細菌鑒定法檢測，雖具有一定的效果，但是存在操作步驟復雜、檢測耗時長等缺點。而隨著醫療科技的不斷完善，發現熒光定量PCR 法通過檢測沙門菌和志賀菌DNA 來檢測腹瀉感染也可取得理想的檢查效果。但是目前臨床對于熒光定量PCR 法和常規細菌鑒定法對腸道病原菌（沙門菌和志賀菌）的陽性檢出符合率是否統一尚未明確[2]。鑒于此，本文將60 例患者進行分析，總結熒光定量PCR 法與常規細菌鑒定法的方法，試探討其患者腸道致病菌檢測的影響，詳細報告內容請看下文。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究例數有60 例，研究時間在2020年1月-2020年12月，研究對象是腹瀉患者，60 例患者中男女的比例為33:27；患者年齡主要集中在6 個月-68 歲，平均（34.56±10.24）歲。對比分析患者的各項資料，具有可比性（P＞0.05）

納入標準：①60 例患者經臨床檢查確診為腹瀉；②患者神志清醒，能夠進行簡單的交流，可以配合完成檢測；③患者及家屬簽字同意參加研究，并且獲取醫學委員會的審核通過。

排除標準：①患者的心肝腎等器官存在嚴重器質性病變；②患者并發嚴重全身感染；③患者的精神異常，不能正常交流，無法配合完成檢查；④患者的病歷資料不齊全或者不愿參加研究。

1.2 方法

①60 例患者展開常規細菌鑒定法檢測，具體檢測方法為：訩標本采集：患兒入院后，護士告知家屬糞便收集方法，并為家屬發放糞便收集器，采用5 支無菌棉擦拭多點采集糞便標本，采集完新鮮的大便標本后，立即將其置入無菌盒中，并送往檢驗科進行檢測。訪檢測方法：培養溫度設置為35oC，培養時間大約為18-24 小時，之后采用劃線的方法接種到SS瓊脂、XLD 瓊脂，并在平板培養基中進行培養，培養基的溫度保持在37oC，仔細觀察致病菌的顏色變化情況，對于少數可疑病菌，可將其進行涂片和染色處理后進行固定制片，采用顯微鏡進行觀察，必要時可進行血清血凝集試驗，直至鑒定出致病菌。②60 例患者展開熒光定量PCR 法檢測，詳細檢測過程為：訩采用一次性多功能采樣器收集患者的肛拭子，將收集的標本放入沙門菌-志賀菌增菌液中進行增菌，增菌時間在3 個小時到5 個小時；訪使用一次性滴管吸入增菌液，并在1.5ml 的無菌離心管中滴入2 滴增菌液，將20 人份的肛拭子增菌液置入同一個1.5ml 的無菌離心管中，然后進行離心分離，離心速度設為每分鐘10000r，離心時間為3 分鐘，離心分離結束后去掉上清，并保留50μl 的低層液；訫在試管中加入50ml 的DNA 提取液，等到液體沉淀懸浮后開大火進行煎煮，溫度設為100oC，煎煮時間為5 分鐘，然后進行二次離心分離，離心時間為3 分鐘，離心速度為每分鐘10000r，之后將5μl 上清液滴入滅菌離心管中；④選擇濟南好來寶醫療器材有限公司生產的熒光定量PCR 儀（型號為：CFX Connect）進行擴增，反應體系設為25μl；檢測途徑：沙門菌FAM，志賀菌VIC；循環參數設為：每3 分鐘94℃作為一個循環；每30秒93℃至每45 秒55℃為44 個循環。

1.3 觀察指標

比較熒光定量PCR 法與常規細菌鑒定法的檢測結果，仔細記錄兩種方法中沙門菌和志賀菌的例數。

1.4 統計學方法

研究所得數據均錄入至Excel 2010 中予以校對，采用SPSS 23.0 軟件進行處理。百分比（%）表示計數資料，計數資料用卡方（χ2）檢驗。P評定檢驗結果，P＞0.05 提示無統計學差異，P＜0.05 提示有統計學差異。

2 結果

2.1 評價分析兩種檢測方法在沙門菌陽性率的差異

從表1 的結果能夠看出，在沙門菌陽性率上，熒光定量PCR 法為8.33%，常規細菌鑒定法為5.00%，熒光定量PCR法略高于常規細菌鑒定法，差異不大（P＞0.05）。

表1 評價分析兩種檢測方法在沙門菌陽性率的差異[n(%)]

2.2 評價分析兩種檢測方法在志賀菌陽性率的差異

從表2 的結果可以發現，熒光定量PCR 法檢測的志賀菌陽性率為6.67%，常規細菌鑒定法檢測的志賀菌陽性率為3.33%，熒光定量PCR 法略高于常規細菌鑒定法，比較差異不大（P＞0.05）。

表2 評價分析兩種檢測方法在志賀菌陽性率的差異[n(%)]

3 討論

腹瀉是臨床上比較常見的疾病，也是患者營養不良的影響因素，不利于患者的正常生長發育。腹瀉主要是指由多種病因引起的以腹瀉為主的一類疾病，具有病因多樣、流行范圍廣、缺乏有效預防措施的特點，5 歲以下的兒童是該疾病的主要發病人群，臨床上主要表現為腹痛、大便次數增多、發熱等癥狀，給患者的日常生活帶來不良影響[3]。患者發生腹瀉后，若是沒有及時采取有效、正確的治療措施，可能會對患者的生命安全構成威脅，已經是造成發展中國家嬰幼兒死亡的重要原因之一，成為全球重要的公共衛生問題，對社會穩定、經濟發展以及人們的生活、工作產生巨大的損害[4]。腸道感染是腹瀉發生的重要原因，而沙門菌和志賀菌是臨床比較常見的腸道致病菌，其中沙門菌是寄生在人類腸道內生化反應和抗原構造相似的革蘭陰性桿菌；而志賀菌又被成為痢疾桿菌，是人類細菌性痢疾的病原菌，可在人與人之間廣泛傳染[5]。沙門菌與志賀菌主要是由于食用受到污染的食物或者飲用受到污染的水源引起的，具有傳染性[6]。因此，選擇合理有效的診斷方式對于疾病的防治具有重要的意義。

常規細菌鑒定法是臨床檢測沙門菌和志賀菌的常用方法，其通過細菌培養、生化鑒定、血清檢測等進行鑒別診斷，可有效檢測出沙門菌和志賀菌；但是，常規細菌鑒定法的檢測過程復雜，獲取檢測報告的等待時間長，需要用到的試劑比較多，對檢驗科人員的技術要求極高，且受到外界因素的影響較大，限制了臨床應用范圍[7]。隨著分子生物技術的發展與完善，熒光定量PCR 法逐漸用于微生物的鑒別診斷中，取得了較好的檢測效果，目前已在感染性疾病中廣泛應用[8]。熒光定量PCR 法是聚合酶鏈式反應是一種實驗室檢測，利用一段DNA 為模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下，將該段DNA 擴張至足夠數量，以便進行結構和功能分析[9]。相較于常規細菌鑒定法，熒光定量PCR 法將20 人份的樣品合成一個上機樣品，降低了成本，使得價格能夠為患者所接受。本次研究發現，在沙門菌陽性率和志賀菌陽性率上，多重熒光定量PCR 法略高于常規細菌鑒定法（P＞0.05），這與李芬[10]的研究報告結果較為一致，說明采用熒光定量PCR 法檢測腸道致病菌的效果顯著，且安全可靠。

綜上所述，多重熒光定量PCR 法用于腸道致病菌檢測的效果理想，可以快速檢測出腸道致病菌類型，為疾病診斷和治療提供了依據，具有較好的臨床推廣意義。