糖尿病腎病發展為終末期腎病潛在機制的生物信息學研究

李 君 李 見 王世信

1.棗莊市立第四醫院內一科，山東棗莊 277599；2.徐州市中心醫院檢驗科，江蘇徐州 221009

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的重要并發癥之一，已成為發達國家終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）的首要危險因素[1]。透析治療是目前ESRD主要的治療方式，但透析治療容易并發心血管意外、血管相關意外、感染等并發癥，增加ESRD的死亡率[2]。ESRD的發病機制和安全有效的治療方案有待進一步研究。DN是ESRD發病的獨立危險因素[3]。有證據表明，炎性反應參與DN的病理過程，DN發病與TLR-4/NFκB信號通路密切相關[4]。但DN發展為ESRD的具體機制尚未完全明確。目前，基因組學在醫學領域的應用范圍逐漸擴大，以基因組學為基礎的生物信息學方法可短時間內獲取并分析海量的基因表達數據，深入挖掘疾病的潛在機制和核心通路[5]。本研究利用生物信息學方法挖掘DN發展為ESRD的潛在機制和核心靶點，為ESRD的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 DN和ESRD差異表達基因篩選

在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中檢索獲取芯片數據。下載GSE142153數據集，該數據集包含7例ESRD患者、23例DN患者、10例健康對照對象的外周血單個核細胞的基因表達數據。利用R語言軟件中的“limma”和“pheatmap”對 GSE142153數據集進行標準化處理，以P＜0.05、|fold change|≥2為條件進行差異表達基因篩選和聚類分析，并將結果可視化。

1.2 DN和ESRD共同差異表達基因篩選

將DN和ESRD差異表達基因導入生物信息學與進化基因組學網站的韋恩圖繪制模塊，分別將上調和下調的DN和ESRD差異表達基因取交集，即可獲得DN和ESRD共同差異表達基因，即DN發展為ESRD的潛在靶基因，繪制韋恩圖。

1.3 潛在靶基因富集分析

以P＜0.05為條件，利用R語言“ClusterProfiler”數據包對篩選得到的潛在靶基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路和基因本體（gene oncology，GO）富集分析，并將富集結果可視化。

2 結果

2.1 DN差異表達基因篩選

經標準化處理和篩選，與正常對照組相比，DN組樣本存在160個差異基因，其中上調基因100個，下調基因60個；ESRD組樣本存在74個差異基因，其中上調基因37個，下調基因37個。經數據標準化和聚類分析，繪制數據標準化后差異基因表達火山圖和熱圖，見圖1。

圖1 使用Fold change和校正后P值繪制火山圖和熱圖

2.2 DN和ESRD共同差異表達基因篩選

將上調和下調的DN和ESRD差異表達基因分別取交集，獲得DN和ESRD共同上調差異表達基因12個，下調差異表達基因10個，即DN發展為ESRD的潛在靶基因，繪制韋恩圖，見表1及圖2。

表1 DN和ESRD共同差異表達基因

圖2 DN和ESRD差異表達基因韋恩圖

2.3 潛在靶基因富集分析

富集分析結果表明，上調的潛在靶基因顯著富集于氮素代謝信號通路；涉及蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉移酶活性等分子功能、血紅蛋白復合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學過程。下調的潛在靶基因未得到相關富集結果，表明DN發展為ESRD的過程中，差異基因以上調表達為主，見圖3。

圖3 潛在靶基因富集分析

3 討論

DN是最常見的慢性腎臟疾病，也是ESRD的主要原因[6]。DN被認為是血流動力學和代謝因素相互作用的結果，其發病機制涉及多因素、多途徑，其中炎癥起主要作用[7]。此外，氧化應激反應也是加重DN患者腎損傷的重要因素，可加快DN向ESRD進展的速度[8]。有學者認為，血、尿腎損傷分子（kidney injury molecule，KIM）1水平可能成為DN進展的生物標志物[9]，也有研究指出，TNF受體超家族成員與ESRD的發病密切相關[10]。但DN向ESRD進展的潛在機制尚未完全明確。ESRD嚴重影響患者的生活質量[11]，明確ESRD的發病機制，探索其發病的關鍵靶點，對提高ESRD療效、改善患者的生活質量意義重大。

本研究利用生物信息學方法挖掘發現，DN發展為ESRD的過程中，差異基因以上調表達為主，上調的潛在靶基因顯著富集于氮素代謝信號通路；涉及蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉移酶活性等分子功能、血紅蛋白復合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學過程。

氮的代謝水平與腎病關系密切，研究表明，當合并急性腎損傷時，患者腎小球濾過能力顯著降低，含氮以及非含氮代謝產物發生蓄積，患者死亡率增加[12]。與腎病相關的非蛋白氮代謝產物分別有血清肌酐、尿素氮、尿酸等，也是腎功能的重要指標[13]。研究表明，腸道菌群與慢性腎臟病關系密切，腸道菌群可以通過促進含氮廢物的排除等途徑，減輕腎衰竭模型動物的腎損傷程度[14]。

γ-谷氨酰轉移酶是一種細胞分泌酶，主要存在于腎臟、胰腺、肝臟等組織器官中。研究證實，γ-谷氨酰轉移酶與慢性腎臟病的進展程度密切相關，可以作為慢性腎臟病進展的獨立預測因素[15]。韓國一項納入600余萬例的研究表明，γ-谷氨酰轉移酶可以作為ESRD進展的預測因子[16]。

鐵參與人體的多種生理過程，包括氧的運輸、酶的活性和能量的代謝等。鐵穩態失衡與多種病理過程有關，鐵穩態的紊亂和鐵介導的細胞毒性與腎臟損傷互為因果[17]。腎臟通過尿液的重吸收過程參與全身鐵穩態的調節，腎臟中鐵的蓄積和尿中鐵濃度的增加與各種腎臟疾病和腎損傷的病理過程相關[18]。鐵在紅細胞生成和血紅蛋白的合成過程中發揮重要作用，這使得紅細胞的生成過程消耗了體內絕大部分鐵，也是體內鐵代謝的重要途徑。紅細胞生成過程中，赤鐵酮表達增多，可以抑制鐵調素的表達，調劑體內鐵的平衡[19]。血紅蛋白復合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學過程可能會通過介導鐵的代謝發揮干預終末期腎病的病理過程。

綜上所述，DN發展為ESRD的過程中，差異基因以上調表達為主，上調的潛在靶基因顯著富集于氮素代謝信號通路；涉及蛋白質-谷氨酰胺γ-谷氨酰轉移酶活性等分子功能、血紅蛋白復合物等細胞組分和紅細胞分化等生物學過程。本研究挖掘獲取的差異基因均來自DN、ESRD和健康人的外周血液樣本的測序結果，但由于樣品標準化和富集分析過程中可能存在的主觀因素影響，研究結果可能存在偏差，挖掘得到的核心靶點和信號通路在DN發展為ESRD過程中的機制有待進一步實驗驗證。