EM患者子宮內膜組織的ESCs中miR-539表達水平及其靶向MMP-9對ESCs侵襲和遷移的影響

肖田 ，廉紅梅

子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）常見于育齡婦女，是一種良性、慢性的婦科疾病，具有雌激素依賴性，以存在侵襲性異位內膜為特征，且與許多臨床癥狀和體征密切相關，如盆腔疼痛、痛經(jīng)、不孕和性交困難等［1-2］。關于EM 的發(fā)病機制有3 種學說，其中最有說服力的是月經(jīng)逆行學說，即子宮內膜碎片植入子宮外部，如腹膜和腹部器官，尤其是卵巢［3］。細胞遷移和侵襲在子宮內膜異位囊腫的形成中起重要作用，但其分子機制尚不清楚。因此，需要進一步探討EM 的發(fā)病機制，以找到更有針對性的治療方法。EM表現(xiàn)為良性形態(tài)，然而子宮內膜基質細胞（endometrial stromal cells，ESCs）具有侵襲潛能，EM 常表現(xiàn)出一些惡性特征，如侵襲性增加、血管生成異常以及組織粘連廣泛［4］。已有研究表明，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）可能在EM 的發(fā)病機制中起重要作用。MMPs 可通過降解細胞外基質促進細胞遷移和侵襲，并廣泛參與血管重塑，這些是EM 形成的必要過程［5］。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是一種小的非編碼RNA，在調節(jié)細胞增殖、凋亡、細胞周期、免疫反應和炎癥的基因表達中發(fā)揮重要作用［6］。MiRNA的失控和異常表達與人類多種疾病有關［7］。MiR-539具有抑制乳腺癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌等多種腫瘤細胞侵襲和遷移的作用［8］，且經(jīng)生物信息學檢測后發(fā)現(xiàn)，miR-539 與 MMP-9 的 3′- 非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）具有結合位點，兩者具有明顯的靶向關系。本研究通過檢測miR-539 在EM 患者子宮異位組織以及正常子宮內膜組織中的表達，探討miR-539靶向MMP-9對ESCs侵襲和遷移的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入湖北省婦幼保健院2016年10月—2020年 1 月收治的 EM 患者 60 例，年齡 24～46 歲，平均（30.56±3.81）歲。依據(jù)修訂后的美國生育學會子宮內膜異位癥（rAFS）分期評定為Ⅰ～Ⅱ期24 例，Ⅲ～Ⅳ期36 例。患者手術前至少3個月未接受激素治療，且無其他盆腔病變。收集以上患者術中子宮內膜異位組織，設為EM組。另取47例年齡匹配的子宮肌瘤等良性婦科疾病患者的正常子宮內膜組織設為對照組。以上組織樣品均在無菌條件下采集，并送到實驗室進一步處理。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準（文號：160805-1），取得所有研究對象知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 Lipofectamine 3000 試劑盒（L3000001）購自 Thermo Fisher Technology 公司。RNA 提取試劑盒（貨號：DP419）購自北京天根生化科技有限公司。PrimeScript RT 試劑盒（貨號：RR036）及實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（貨號：RR820）購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號：D0010）購自北京索萊寶生物科技有限公司。miR-539 mimics、miR-539 inhibitors及其陰性對照由廣州銳博生物科技有限公司合成 。 miR-539 mimics 序 列 ：上 游 5′-GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU-3′；下 游 5′-ACACCAAGGAUAAUUUCUCCAUU-3′，雙鏈。對照序列：上游5′-GCCCUACAACUCCCACUCUGUAC-3′ ；下 游 5′-AUUGCCCAAAUAACCGCUACCGU-3′。 miR-539 inhibitor 序 列 ：5′-ACACACCAAGGAUAAUUUCUCCC-3′；對照序列：5′-UCGGGCCUGGAUAGCCCGAUCU-3′，采用 2-O 甲氧基修飾。MMP-9 一抗、內參一抗及二抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司。光學顯微鏡購自日本尼康公司；熒光定量PCR（qPCR）儀、蛋白電泳儀和轉膜儀均購自美國Bio-Rad 公司；GIS-500 型凝膠成像儀購自杭州Miulab公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞分離培養(yǎng) 清洗子宮內膜組織，切成小碎片，在37 ℃下于含有Ⅳ型膠原酶（1 g/L）的DMEM/F12 培養(yǎng)基中孵育35 min。然后，使用400 目尼龍細胞過濾器過濾分離分散的子宮內膜細胞，離心后收集濾液中的基質細胞，并將其重懸于含有10%FBS 的DMEM/F-12 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h。根據(jù)人波形蛋白陽性和人角蛋白陰性的細胞染色，結果顯色，ESCs的純度高于95%［9］。

1.3.2 qPCR檢測miR-539和MMP-9 mRNA的表達水平 使用RNA 提取試劑盒提取2 組ESCs 中的RNA，并利用分光光度計測定RNA 濃度。然后使用PrimeScript RT 試劑盒反轉錄成cDNA。miR-539的反轉錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACACAC-3′，U6 的反轉錄通用引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。然后使用qPCR 儀進行檢測。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，45 個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。以 U6 和 β-actin 為內參基因，采用 2-ΔΔCt對組織中miR-539 和MMP-9 mRNA 表達水平進行相對定量分析。根據(jù)基因庫數(shù)據(jù)庫中基因序列的公開數(shù)據(jù)設計引物，引物序列見表1。

Tab.1 qPCR primer sequence表1 qPCR引物序列

1.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測 采用TargetScan 軟件分析，預測miR-539和MMP-9 3′-UTR 存在結合位點。將含有miR-539 結合位點的野生型（WT）和突變型（MUT）MMP-9 3′-UTR基因序列插入熒光素酶報告基因的載體pGL3上，構建相應的質粒載體，然后將WT-MMP-9、MUT-MMP-9 分別與 miR-539 mimics、miR-539 NC 共轉染 ESCs。48 h 后收集細胞，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.3.4 細胞轉染及分組 將EM 組的ESCs 混合培養(yǎng)至生長對數(shù)期，接種于6孔板上。利用Lipofectamine 3000試劑轉染ESCs，并將其分為 miR-539 mimics 組、mimics NC 組、miR-539 inhibitors 組和 inhibitors NC 組。并在 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)檢測。細胞實驗均設3個平行，重復實驗2次，取其平均值。

1.3.5 CCK-8 檢測細胞增殖 按照1.3.4 中方法轉染細胞至96孔板中（每孔3 000個細胞）培養(yǎng)，24、48、72 h后，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液。然后在37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶標儀檢測450 nm處光密度（OD）值。

1.3.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 將1.3.4 轉染后的各組細胞培養(yǎng)在6孔板中，然后用200 μL吸管尖端劃破細胞單層。用添加1%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)，以減少細胞增殖的影響。在劃后0 h和24 h用顯微鏡觀察并拍攝具有代表性的圖像。使用Image-Pro Plus分析軟件對遷移距離進行定量，計算劃痕愈合率=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.3.7 Transwell 檢測細胞侵襲 將1.3.4 轉染后的細胞懸液（2×104個細胞）100 μL等量放入Transwell板（含Matrigel基質膠）上室。下室裝滿700 μL 含10%FBS 的DMEM/F-12 培養(yǎng)基。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，取出上室，下室細胞用3.8%甲醛固定20 min 后，0.1%結晶紫染色。然后使用顯微鏡觀察，并用Image-Pro Plus軟件計數(shù)每個視野的細胞數(shù)。

1.3.8 Western blot法檢測MMP-9蛋白表達水平 將轉染后的細胞加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，然后使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并檢測蛋白含量。使用SDS-PAGE分離總蛋白，然后轉移到PVDF 膜上。在室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后將膜上的蛋白質與MMP-9 一抗以1∶1 000的稀釋度在4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌3次。在室溫下與二抗孵育1 h，TBST洗膜。曝光顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白相對表達量，以β-actin為內參蛋白。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，2 組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-539 和MMP-9 mRNA 表達水平變化 與對照組相比，EM 組miR-539 mRNA 水平顯著降低，MMP-9 mRNA水平顯著升高（P＜0.01），見表2。

2.2 miR-539與MMP-9靶向關系的預測與驗證 生物信息學預測結果顯示，MMP-9 3′-UTR 序列上存在miR-539 連續(xù)的結合位點，見圖1。與miR-539NC+WT-MMP-9 組 相 比 ，miR-539 mimics+WTMMP-9 組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），miR-539 mimics+MUT-MMP-9 組和miR-539 NC+MUTMMP-9 組熒光素酶活性無明顯變化（P＞0.05），見圖2。

Tab.2 Comparison of miR-539 and MMP-9 mRNA expression levels between the two groups of ESCs表2 2組ESCs中miR-539和MMP-9 mRNA表達水平的比較 （）

Tab.2 Comparison of miR-539 and MMP-9 mRNA expression levels between the two groups of ESCs表2 2組ESCs中miR-539和MMP-9 mRNA表達水平的比較 （）

＊＊P＜0.01

組別n miR-539MMP-9 mRNA對照組EM組t 60 47 1.00±0.08 0.43±0.04 44.639＊＊1.00±0.05 1.85±0.07 73.223＊＊

Fig.1 The binding site of miR-539 and MMP-9 3′-UTR predicted by bioinformatics圖1 生物信息學預測miR-539與MMP-9 3′-UTR結合位點

Fig.2 Comparison of the relative activity of luciferase between the four groups of ESCs(n=6)圖2 4組ESCs細胞熒光素酶相對活性的比較（n=6）

2.3 miR-539 過表達對 EM 患者 ESCs 細胞增殖的影響 72 h 時，與 mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組ESCs 細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）；48、72 h 時 ，與 inhibitors NC 組 相 比 ，miR-539 inhibitors 組ESCs 細胞增殖能力顯著升高（P＜0.05），見圖3。

2.4 miR-539 過表達對 EM 患者 ESCs 細胞遷移的影響 與 mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組ESCs 細胞的劃痕愈合率顯著降低（P＜0.05）；與inhibitors NC 組相比，miR-539 inhibitors 組 ESCs 細胞的劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）。見圖4、5。

Fig.3 Comparison of the proliferation ability of ESCs cells at different time points between the four groups(n=6)圖3 4組ESCs細胞不同時間點增殖能力的比較（n=6）

Fig.4 Comparison of cell migration ability between the four groups of ESCs圖4 4組ESCs細胞遷移能力的比較

2.5 miR-539 過表達對 EM 組 ESCs 細胞侵襲的影響 與 mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組 ESCs的侵襲細胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；與inhibitors NC 組相比，miR-539 inhibitors 組 ESCs 的侵襲細胞數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。見圖6、7。

Fig.5 Comparison of Scratch healing rate between the four groups of ESCs(n=6)圖5 4組ESCs細胞劃痕愈合率的比較（n=6）

Fig.7 Comparison of the number of invasive cells between the 4 groups of ESCs(n=6)圖7 4組ESCs細胞侵襲細胞數(shù)量的比較（n=6）

2.6 miR-539 過表達對 EM 組 ESCs 細胞中 MMP-9蛋白表達的影響 與mimics NC 組相比，miR-539 mimics 組ESCs 細胞MMP-9蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與 inhibitors NC 組 相 比 ，miR-539 inhibitors 組ESCs 細胞的MMP-9 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖8、9。

Fig.8 Expression of MMP-9 protein in four groups of ESCs圖8 4組ESCs細胞中MMP-9蛋白表達情況

Fig.9 Comparison of the relative expression levels of MMP-9 protein between the 4 groups of ESCs(n=6)圖9 4組ESCs細胞中MMP-9蛋白相對表達水平的比較（n=6）

3 討論

3.1 miR-539 的表達水平與EM 的發(fā)生發(fā)展有關 EM是一種良性婦科疾病，但其病變具有癌性特征，如細胞侵襲、遷移和增殖等。人類子宮內膜是由不同細胞組成的復雜組織，包括腔上皮和腺上皮、間質細胞和免疫細胞。ESCs 在子宮內膜中的細胞數(shù)量最多，表明它們在維持子宮內膜的正常功能方面發(fā)揮著重要作用［10］。miRNA 是一組長度小于 24 個核苷酸的非編碼RNA，在轉錄后水平調節(jié)基因表達。近年來，miRNAs作為特定基因表達的抑制因子被認為參與了子宮內膜的調控。各種miRNAs 在EM 中的異常表達已有報道［11-12］。同時 miR-539 在卵巢癌［13］、乳腺癌［14］等腫瘤中均異常表達。miR-539過表達可顯著抑制癌細胞的侵襲和遷移。本研究顯示，EM患者ESCs中miR-539水平明顯下調，表明miR-539的表達水平與EM的發(fā)生發(fā)展有關。

3.2 miR-539可抑制ESCs的增殖、侵襲和遷移 為確定miR-539 在ESCs 中的作用，本研究將miR-539 mimics 和 miR-539 inhibitors 轉染至 ESCs。CCK-8結果顯示，轉染miR-539 mimics 的細胞增殖率明顯降低，而轉染miR-539 inhibitors 的細胞增殖率則升高。ESCs 具有侵襲和遷移能力，這可能與EM 的發(fā)病機制有關［15］。本研究顯示，miR-539 過表達可抑制ESCs的細胞侵襲和遷移能力，而抑制miR-539表達則可增強細胞侵襲和遷移能力，表明miR-539 在子宮內膜異位病變的發(fā)生發(fā)展中起著潛在的抑癌基因作用，miR-539可能通過抑制細胞增殖、侵襲和遷移而參與EM的發(fā)生發(fā)展。

3.3 miR-539 靶向調節(jié)MMP-9 來影響EM MMPs是一個內肽酶家族，可參與細胞外基質和基底膜的降解，這也是細胞遷移和侵襲的關鍵步驟。MMP-9是重要的細胞外金屬蛋白酶，在EM 患者體內表達明顯升高，可促進EM 細胞遷移和侵襲［16］。本研究顯示，ESCs 細胞轉染 miR-539 mimics 后，MMP-9 蛋白水平降低，而miR-539 inhibitors 轉染后，MMP-9水平明顯升高，表明miR-539 過表達可能通過下調MMP-9 的表達來抑制ESCs 的遷移和侵襲。因此，推測miR-539 可能是一種EM 抑制基因。另外，熒光素酶實驗結果也證明了MMP-9 是miR-539 的直接靶標。miR-539過表達可抑制MMP-9水平，而抑制miR-539 則結果相反，表明miR-539 靶向調節(jié)MMP-9 的水平，提示其有可能成為EM 的分子標志物。

本研究表明，miR-539 在 EM 患者 ESCs 中表達下調，miR-539 過表達可下調MMP-9 水平，抑制ESCs 的遷移和侵襲，提示miR-539 可能成為治療EM 的潛在靶點。然而，miR-539 在EM 中的具體作用和機制仍有待進一步研究。