褪黑素對年齡相關性黃斑變性模型小鼠視網膜氧化損傷的保護機制研究

董偉華，魏抗抗，帖紅艷，何章彪，趙琳

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是一種與年齡有關的致盲性退行性眼底疾病，隨著人口老齡化加劇，發病人數逐年增加［1］。AMD 發病機制復雜，視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）變性造成視網膜感受器細胞退化，是導致視覺受損的一個因素，影響RPE 變性的機制可能有炎癥、氧化應激和線粒體功能紊亂等［2］。碘酸鈉（NaIO3）是強氧化劑，可作為視網膜毒素，造成RPE損傷，因此可用于誘導視網膜病變復制干性AMD。褪黑素（melatonin，MEL）作為抗氧化劑能夠清除氧自由基，抑制氧化應激反應，增加抗氧化酶的表達［3］。MEL在視網膜中可以清掃羥基自由基，保護色素上皮免受氧化損傷，但在AMD 中水平降低［4］。目前尚不明確增加MEL的表達能否減輕AMD癥狀，相關的動物模型研究也較少。沉默信息調節因子1/叉頭狀轉錄因子1（silent mating type information regulation 2 homolog 1/forkhead box transcription factor O1，SIRT1/FOXO1）通路具有調控氧化應激作用［5］。MEL可以激活SIRT1/FOXO1通路發揮作用［6］，而MEL在AMD中是否通過影響SIRT1/FOXO1 通路發揮作用目前尚不清楚。本研究通過NaIO3誘導建立 AMD 小鼠模型，探討MEL 對 AMD的影響及作用機制，為治療AMD 提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 NaIO3粉末（武漢沃弗化工有限公司）；MEL（西安拉維亞生物科技有限公司，CAS登陸號73-31-4，純度99%）；熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字：H44023401）；HE 染色試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒，一抗SIRT1（兔源）、FOXO1（兔源）及山羊抗兔二抗均購自英國abcam 公司；一抗Ac-FOXO1（兔源）購自英國Abbkine公司。眼底熒光造影儀（日本ITO公司，型號：TRC-50DX）；蛋白凝膠成像系統（上海Tanon公司，型號：Tanon4600）。

1.2 實驗動物 90只SPF級雄性BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，7 周齡，體質量（20±2）g。飼養條件：溫度（23±1）℃、濕度（50±5）%，自然光照，自由飲水飲食。所有實驗過程符合3R 原則，本研究經商丘醫學高等專科學校動物倫理委員會審核并批準。

1.3 方法

1.3.1 動物造模與分組 實驗前所有小鼠經眼科裂隙燈下檢查均未發現眼部異常。90 只小鼠按隨機數字表法分為正常組，模型組及MEL 低、中、高劑量組，每組18 只。NaIO3粉末用生理鹽水溶解，制成20 g/L溶液，4 ℃冰箱暫存。除正常組外的各組小鼠參照文獻［7］尾靜脈注射25 μL/g NaIO3，注射完成后將小鼠放置安靜、潔凈、溫暖環境中直至蘇醒再進行后續實驗；正常組小鼠尾靜脈注射等體積生理鹽水。小鼠蘇醒后MEL 低、中、高劑量組分別以10、20、40 mg/kg MEL 灌胃，MEL 溶于生理鹽水中配制成固定1 mL 溶液灌胃；正常組、模型組灌胃等體積生理鹽水，1次/d，持續1周。

1.3.2 樣品收集 實驗結束后所有小鼠眼眶靜脈取血，多次采血，取300～400 μL。室溫靜置2 h，1 000 r/min離心10 min，取上清液待用。每組采用隨機數字表法抽取6只觀察眼底情況；6只摘除眼球，置于4%多聚甲醛中固定保存；剩余6只摘除眼球，分離出視網膜，置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 眼底熒光造影儀檢測 小鼠散瞳，10%熒光素鈉注射液（2 mL/kg）腹腔注射，待熒光素鈉循環至眼底，眼底熒光造影儀對小鼠右眼行熒光素眼底血管造影（FFA）；FFA 檢查后行光學相干斷層掃描（OCT），再行眼底照相。由兩位操作熟練的眼科工作者測量視網膜厚度。

1.3.4 HE染色檢測視網膜形態 4%多聚甲醛固定眼球后，經石蠟固定包埋，平行眼軸方向連續切片，厚度5 μm。視網膜切片蘇木素染色，蒸餾水沖洗，滴加伊紅染液復染。經二甲苯透明，中性樹膠封片后，光學顯微鏡（×200）觀察視網膜結構。

1.3.5 眼眶靜脈血SOD、GSH-Px、CAT 活性檢測 分別在550、405、412 nm 波長處采用試劑盒檢測血清中SOD、GSHPx、CAT的光密度（OD）值，計算對應酶活性。

1.3.6 Western blot 檢測小鼠視網膜中 SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1 蛋白水平 視網膜中添加蛋白裂解液冰上研磨，10 000 r/min，4 ℃離心20 min，上清為總蛋白。BCA試劑盒測蛋白濃度，每孔上樣20 ng，經凝膠電泳分離、PVDF 膜轉膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，添加一抗 SIRT1（1∶1 000）、FOXO1（1∶2 000）、Ac-FOXO1（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育過夜；洗膜后添加山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，DAB顯色試劑盒避光顯色，蛋白凝膠成像系統拍照和定量分析。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MEL 對小鼠眼底影響 正常組小鼠視網膜血管自視盤向周圍發出均勻的大血管，分支良好且延伸到視網膜周圍；模型組視盤消失，血管出現收縮現象，視網膜變白。隨著MEL 劑量的升高，逐漸顯示出視盤，視網膜恢復。見圖1。

2.2 MEL 對小鼠眼底FFA 影響 正常組熒光均勻分布于血管內；模型組血管出現破裂，熒光出現滲漏現象；隨著MEL 劑量的升高，熒光滲漏現象逐漸緩解。見圖2。

Fig.1 Color photographs of the fundus in 5 groups of mice圖1 5組小鼠眼底彩照視網膜情況

Fig.2 FFA inspection results of 5 groups of mice圖2 5組小鼠FFA檢查結果

2.3 MEL對小鼠視網膜厚度的影響 正常組、模型組、MEL低劑量組、MEL中劑量組、MEL高劑量組視網膜厚度（μm）分別為 310.16±6.46、220.49±8.48、259.65±8.19、268.16±8.33、298.80±8.17，5 組間比較差異有統計學意義（n=6，F=118.196，P＜0.05）。與正常組相比，模型組，MEL 低、中劑量組視網膜厚度降低（P＜0.05）；與模型組相比，MEL 低、中、高劑量組視網膜厚度增加（P＜0.05）；與MEL 低、中劑量組相比，MEL 高劑量組視網膜厚度增加（P＜0.05）。見圖3。

2.4 MEL 對小鼠視網膜形態影響 正常組視網膜各層細胞排列整齊且緊密；模型組視網膜各層細胞排列紊亂，外核層排列松散，細胞嵌入內節段/外節段（IS/OS），內核層（INL）細胞變大且松散排列，RPE沉積物量增多，細胞出現空泡狀。隨著MEL劑量的升高，各層細胞逐漸排列整齊，外核層（ONL）、INL細胞緊密排列，RPE沉積物量減少。見圖4。

2.5 MEL 對血清中 SOD、GSH-Px、CAT 活性的影響 與正常組相比，模型組和MEL低、中、高劑量組的血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性降低（P＜0.05）；與模型組相比，MEL 低、中、高劑量組血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）；與MEL 低劑量組相比，MEL 中劑量組血清中 SOD、GSH-Px 活性升高，MEL 高劑量組血清中 SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）；與MEL 中劑量組相比，MEL 高劑量組血清中SOD、GSH-Px 活性升高（P＜0.05），見表1。

2.6 MEL對視網膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平的影響 5組視網膜中FOXO1蛋白差異無統計學意義。與正常組相比，模型組，MEL 低、中劑量組視網膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平降低，MEL高劑量組視網膜中Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，MEL 低劑量組視網膜中SIRT1 蛋白水平升高（P＜0.05），MEL 中、高劑量組視網膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平升高（P＜0.05）；與MEL低、中劑量組相比，MEL高劑量組視網膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平升高（P＜0.05）。見表2、圖5。

Fig.3 OCT inspection results of 5 groups of mice圖3 5組小鼠OCT檢查結果

Fig.4 Retinal morphology of 5 groups of mice(HE staining,×200)圖4 5組小鼠視網膜形態（HE染色，×200）

Tab.1 Comparison of SOD,GSH-Px and CAT activities in retinal venous blood between the five groups of mice表1 5組小鼠眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性比較 （n=18，U/mL，）

Tab.1 Comparison of SOD,GSH-Px and CAT activities in retinal venous blood between the five groups of mice表1 5組小鼠眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性比較 （n=18，U/mL，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與MEL 低劑量組比較，d與MEL中劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組MEL低劑量組MEL中劑量組MEL高劑量組F SOD 56.42±5.15 26.37±3.42a 31.58±4.16ab 36.72±4.36abc 51.16±5.02abcd 149.026＊＊GSH-Px 156.85±8.18 75.49±6.47a 102.68±7.10ab 134.12±6.78abc 149.55±7.33abcd 403.428＊＊CAT 10.38±1.85 3.96±0.79a 5.46±0.89ab 6.58±0.52ab 7.18±0.86abc 87.834＊＊

Tab.2 Comparison of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in the retina between the 5 groups of mice表2 5組視網膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平比較 （n=6，）

Tab.2 Comparison of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in the retina between the 5 groups of mice表2 5組視網膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平比較 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a與正常組比較，b與模型組比較，c與MEL 低劑量組比較，d與MEL中劑量組比較，P＜0.05

組別正常組模型組MEL低劑量組MEL中劑量組MEL高劑量組F SIRT1 0.21±0.02 0.05±0.01a 0.12±0.02ab 0.14±0.02ab 0.23±0.03bcd 71.591＊＊FOXO1 0.68±0.08 0.59±0.05 0.61±0.09 0.63±0.10 0.68±0.05 1.698 Ac-FOXO1/FOXO1 1.24±0.11 0.12±0.02a 0.19±0.02a 0.23±0.03ab 0.58±0.04abcd 420.526＊＊

Fig.5 SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in retina of 5 groups of mice圖5 5組視網膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平

3 討論

AMD 最大的危害是導致黃斑中心區視力永久性喪失，已成為中國50歲以上人群眼科疾病的第二病種［8］。濕性AMD 與異常的脈絡膜新生血管有關，目前常用治療方法為玻璃體內注射血管內皮生長因子抗體，通過抑制血管新生達到治療目的，且效果較好。干性AMD 主要表現為RPE 被大量破壞造成的視損傷，而RPE對于維持血-視網膜屏障、參與視循環、吞噬脫落細胞等都具有重要作用［9］。RPE 破壞可造成炎癥反應和氧化應激加劇。NaIO3可特異性作用于RPE，導致RPE 屏障和光感受器細胞功能遭到破壞，從而引起視網膜感光細胞、脈絡膜出現病變，造成視網膜損傷，因此減輕氧化損傷對于疾病治療意義重大［10］。MEL 是脊椎動物松果體的主要分泌物，作為吲哚胺類激素，可起抗氧化、抗凋亡作用［11］，能夠清除活性氧自由基，實現對氧化損傷的保護，臨床上可用于治療黃斑變性、青光眼、高血壓、糖尿病等［12］，但在AMD中應用缺乏相關研究。本研究發現，模型組中出現視盤消失、視網膜變白，血管收縮，部分血管出現破裂，視網膜各層細胞排列紊亂、RPE層沉積物量增多，細胞出現空泡狀，視網膜損傷嚴重。MEL 治療后小鼠視盤出現、血管破裂現象好轉，視網膜各層次結構逐漸整齊，且視網膜血管收縮、破裂、視網膜厚度降低現象隨著MEL 劑量的升高逐漸好轉，但其作用機制尚需進一步研究。

SOD 作為自由基清除劑，在機體自由基的產生和清除中發揮重要作用；GSH-Px作為催化過氧化氫分解的酶，其水平與氧化損傷、神經變性等關系密切；CAT作為機體抗氧化系統重要酶，其含量可以評價機體抗氧化能力，三者均作為自由基清除劑在機體發揮作用［13-15］。有研究表明，MEL可以升高SOD、GSH-Px、CAT，降低丙二醛（MDA）水平，從而降低活性氧、減輕氧化應激，保護低溫保存的卵巢組織［16］。本研究中模型組眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性較正常組降低，提示AMD視網膜處機體清除自由基能力降低，可能造成氧自由基堆積，損傷細胞和組織；MEL 治療后眼眶靜脈血血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性升高，提示 MEL 可以增強機體自由基清除能力，實現對氧化損傷的保護。

SIRT1作為腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白脫乙酰酶，可以通過乙酰化組蛋白修飾賴氨酸殘基，FOXO1可以與SIRT1 啟動子區域結合位點直接結合，激活SIRT1，又可通過SIRT1 介導發揮抗氧化、抗炎等作用［17］。上調 SIRT1 的 mRNA 和蛋白表達并抑制FOXO1、FOXO3和FOXO4的mRNA和蛋白表達可預防心肌細胞凋亡［18］。上調SIRT1可以提高高糖條件下足細胞SOD、CAT、GSH-Px活性，減少細胞中活性氧水平及足細胞凋亡，其機制與減輕氧化損傷有關［19］。MEL通過以受體依賴的方式激活SIRT1信號傳導而減輕氧化應激和血管平滑肌細胞損傷，發揮對胸主動脈瘤和夾層的治療作用［20］。本研究中，模型組視網膜組織中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平較正常組降低，提示AMD可抑制SIRT1/FOXO1通路，使該通路發揮抗氧化、抗炎作用降低，導致自由基積累，加重氧化損傷，經MEL治療后，視網膜組織中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平升高，提示MEL 可以激活SIRT1/FOXO1 通路，從而提高SOD、GSH-Px、CAT活性，增加氧自由基的清除能力，減輕氧化損傷。

綜上所述，MEL 可能通過激活SIRT1/FOXO1 通路實現對AMD 視網膜氧化損傷的保護。本文在動物模型上驗證了MEL對AMD的治療作用，可為臨床上AMD的治療提供一定參考依據，但SIRT1/FOXO1通路與MEL之間的具體調控位點尚需進一步驗證。