甘草素抑制HMGB1的表達緩解造血干細胞移植后肝損傷

房 婷，孫鵬帥，劉 潔

(1.解放軍第960醫院，山東 濟南 250031 2.解放軍第69241部隊(衛生連)，新疆 昌吉回族自治州 831700 3.江蘇省常州市第二人民醫院血液內科，江蘇 常州 213000)

造血干細胞移植是目前臨床上治療血液系統疾病的重要措施，但移植后的肝功能損傷嚴重影響預后及患者生活質量[1]。已有報道造血干細胞移植后肝損傷發生率約為60～80%[2,3]。如果總膽紅素在4～7 mg/dL左右，移植后200d內患者死亡率達到50%；而如果總膽紅素高于10 mg/dL，則患者死亡率將高達70%[4]。其發病機制比較復雜，造血干細胞移植后引起的肝小葉結構異常，中心靜脈和肝竇狹窄、阻塞以及纖維蛋白沉積，肝細胞炎性細胞浸潤是公認的普遍發病機制。目前，盡管在臨床上采取毒性較小的預處理方案，如使用抗病毒和抗真菌藥物進行預防、使用免疫抑制策略預防移植物抗宿主病和引入熊去氧膽酸等，在治療以及預防造血干細胞移植引起的肝損傷方面取得了較大進步，但療效并不盡人意[5]。因此，探求更加有效的臨床藥物對于緩解造血干細胞移植后引起的肝損傷迫在眉睫。高遷移率族蛋白B1(High mobility group box 1,HMGB1)是存在于真核生物細胞內一類典型的非組蛋白染色體結合蛋白，參與基因轉錄、DNA修復、細胞分化及細胞外信號傳導[6]。當其釋放到細胞外時，可以誘導多種細胞(如中性粒細胞、單核/巨噬細胞、樹突細胞等)分泌并表達炎性介質，這些炎性介質的分泌又可反過來增加HMGB1的分泌，進而導致一系列炎癥級聯反應[7,8]。甘草素(glycyrrhizin,GL)是甘草根中的主要活性成分，具有抗炎、抗病毒等多種藥理作用，在慢性病毒性肝炎的治療中發揮重要作用。研究表明，甘草素可通過抑制HMGB1的活性緩解肝缺血再灌注損傷[9]。然而甘草素是否可以通過抑制HMGB1的表達改善造血干細胞移植后肝損傷還未見有報道，因此，本實驗通過構建造血干細胞移植后肝損傷模型小鼠，并對模型小鼠進行甘草素灌胃給藥處理，以探討甘草素通過抑制HMGB1的表達，對造血干細胞移植后肝損傷的影響。

1 材 料

1.1動物：選用C57BL /6小鼠為供鼠(動物特征及來源同受體BALB /C小鼠)，BALB/C小鼠為受鼠，清潔級雄性，8周齡，體重22～25g，購于上海斯萊克實驗動物責任有限公司，許可證號：SCXK(滬)2017-0005。

1.2儀器：Fcc-8000型鈷60(60Co)治療機(山東新華醫療器械廠)；Synergy H1型酶標儀(美國Bio-tek公司)；SYD-S3050型石蠟切片機(沈陽譽德電子儀器有限公司)；CX33型光學顯微鏡(美國奧林巴斯)。

1.3試劑：HMGB1 ELISA試劑盒(批號：CSB-E08225m，武漢華美生物工程有限公司)；伊紅染液和蘇木素溶液(批號：714095，珠海貝索生物技術有限公司)；兩步法免疫組化試劑盒(批號：K92413A，北京中杉金橋生物技術有限公司)；抗HMGB1抗體(批號：ZRB1002，美國Sigma)；外源性HMGB1蛋白(批號：H4652，美國Sigma)。

1.4藥物：甘草素(成都曼斯特生物科技有限公司，規格：20mg/支，純度≥98%，批號：A0042)

2 方 法

2.1實驗分組:受鼠按照初始體重隨機分成對照組，模型組和甘草素處理組，每組各8只。其中對照組正常飼養，模型組和甘草素處理組進行手術。為了進一步驗證HMGB1的作用，受鼠分為模型組、抗HMGB1組、甘草素處理組和甘草素+HMGB1組。

2.2小鼠造血干細胞移植后肝損傷模型建立

2.2.1手術前預處理：模型組和甘草素處理組小鼠在移植前一周飲用含抗生素(32萬U/L慶大霉素+0.25g/L頭孢曲松鈉))飲用水。在移植前4h，接受60Co γ射線全身照射7.5Gy，劑量率為：0.67Gy/min。抗HMGB1組處理前腹腔注射100g/20g抗HMGB1(抗HMGB1溶于生理鹽水，濃度為0.5mg/kg)。甘草素+HMGB1組處理前腹腔注射20mg/L的HMGB1蛋白，每只0.5mL。

2.2.2造血干細胞移植：將供體C57BL/6小鼠采用頸椎脫臼處死，碘伏浸泡5～8min后在超凈工作臺上取脛、股骨骨髓及脾臟，在無菌條件下制備骨髓細胞和脾細胞的單細胞懸液，調整細胞濃度為1×107/mL，通過尾靜脈回輸骨髓細胞(5×106個，0.5mL)和脾細胞(1×106個，0.1mL)細胞懸液誘導造血干細胞移植后肝損傷。

2.3給藥方法:造血干細胞移植后，甘草素處理組小鼠采用甘草素灌胃(40mg/kg/d)。對照組和模型組給予同等劑量生理鹽水，連續灌胃14d。

2.4肝臟臟器系數測定:小鼠處死前稱每只活鼠的體質量，處死后稱取肝臟的濕重。肝臟臟器系數=肝臟濕重(g)/活鼠體質量(g)×100%。

2.5標本采集:移植后第15天麻醉小鼠并處死，收集全血和肝組織。取血采用摘眼球取血法，具體操作為：操作者左手固定小鼠，拇指輕壓取血側眼部皮膚使眼球充血突出，再用彎鑷夾取眼球，收集眼眶內流出的血液。將血液分別置于兩個含有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的采血管中，其中一個采血管在室溫靜置30 min后，3000 rpm離心10 min取上清獲得血漿，備用，另一個采血管不做處理，置于4℃冰箱保存備用。摘取肝組織后其中一部分放入液氮速凍并保存于-80℃冰箱；另一部分用10%中性甲醛溶液固定后，用乙醇進行梯度脫水，石蠟包埋。

2.6指標檢測

2.6.1ELISA檢測血漿HMGB1含量，谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)及總膽紅素(TBIL)含量，以及肝組織中炎性相關因子的水平:在移植術后第15天，小鼠摘取眼球采血，按照相應的ELISA試劑盒說明檢測血漿中HMGB1、ALT、AST以及TBIL含量。

2.6.2免疫組化法觀察肝組織中HMGB1的表達:切片經脫蠟、水化、室溫孵育、抗原修復、封閉非特異性位點后，切片滴加稀釋為1∶100的兔抗HMGBl一抗，37℃孵育1h，4℃冰箱過夜，滴加適當稀釋比例的HRP標記的二抗，37℃孵育1h，以二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染封片。陰性對照以PBS替代一抗。在光鏡下觀察染色結果，其中呈棕黃色的細胞為陽性表達細胞。

2.6.3實時熒光定量PCR法檢測肝組織中HMGB1 mRNA的表達水平:①RNA提取:小鼠處死后，取肝組織，置于無菌EP管中凍存。按照RNA提取試劑盒的說明書抽提各組小鼠的肝組織總RNA，儲存于-20℃。②逆轉錄合成cDNA:提取的RNA根據逆轉錄試劑盒的說明分兩步法進行逆轉錄。③實時熒光定量PCR擴增:以cDNA為模板，對肝組織HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α進行實時熒光定量PCR擴增。引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2.6.4HE染色觀察肝組織病理:摘取的肝臟組織用10%中性甲醛固定后，用石蠟將組織標本包埋，后進行切片。將石蠟切片用二甲苯脫蠟，用不同濃度梯度的乙醇脫水，后進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，于顯微鏡下觀察各組受鼠肝細胞、血管內皮損傷、炎癥細胞浸潤以及肝小靜脈閉塞情況。

3 結 果

3.1甘草素對受鼠肝臟指數的影響:模型組的肝臟臟器指數較對照組顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，甘草素處理組肝臟指數明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 甘草素對受鼠肝臟指數的影響

圖1 各組小鼠血漿ALT、AST水平及TBIL的比較

3.2甘草素對受鼠血漿中ALT、AST和TBIL的影響：為了解各組小鼠肝功能水平，檢測血漿ALT、AST和TBIL含量變化，見圖1。結果顯示：造血干細胞移植后，小鼠血漿ALT及AST值相對于對照組均顯著升高(P<0.01)，TBIL水平升高(P<0.05)。經甘草素處理后，小鼠血漿ALT和AST水平相對于模型組顯著降低(P<0.01)，TBIL水平較模型組降低(P<0.05)。

3.3甘草素對受鼠肝組織病理學的影響：對各組小鼠肝臟進行HE染色，根據肝臟組織形態變化及肝臟病理學變化，評價肝損傷情況(圖2)。對照組肝小葉結構清晰，肝細胞排列整齊有序，無病理改變。造血干細胞移植后小鼠出現不同程度的肝損傷：其中模型組小鼠肝小葉正常結構受損，肝細胞排列紊亂，胞質內出現空泡，胞核固縮甚至壞死，出現炎性細胞浸潤；移植后經甘草素處理的小鼠，肝組織病理改變明顯好轉，肝小葉結構部分恢復，肝細胞壞死減輕，炎癥細胞浸潤減少。

圖2 各組小鼠肝組織HE染色(×200)

3.4甘草素對受鼠肝組織TNF-α、IL-6及IL-1β的影響:用實時熒光定量PCR法檢測各組小鼠肝組織TNF-α、IL-6和IL-1β水平(圖3)。結果表明：與對照組相比，模型組肝組織中TNF-α、IL-6及IL-1β的水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，甘草素處理組TNF-α和IL-6的水平顯著降低(P<0.01)，IL-1β水平降低(P<0.05)。

圖3 各組小鼠肝組織TNF-α、IL-6和IL-1β水平

3.5甘草素對受鼠肝組織和血漿HMGB1表達的影響:免疫組化法檢測結果顯示(圖4A)，對照組核內及胞漿內均有少量淺褐色顆粒；造血干細胞移植后可見胞漿內褐色顆粒顯著增多，甚至部分在肝組織內融合成片，形成褐色片狀；經甘草素處理后，小鼠肝組織中褐色顆粒明顯變少。半定量分析結果顯示(圖4B)：與對照組相比，模型組肝組織中HMGB1蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，甘草素處理組肝組織中HMGB1蛋白表達量顯著減少(P<0.01)。運用實時熒光定量PCR檢測肝組織中HMGB1 mRNA表達情況(圖4C)，結果顯示：與對照組相比，模型組肝組織中HMGB1 mRNA表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，甘草素處理組HMGB1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)。ELISA檢測血漿HMGB1含量(圖4D)，與對照組相比，模型組血漿中HMGB1水平顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，甘草素處理組血漿HMGB1水平顯著降低(P<0.01)。

圖4 各組小鼠肝組織和血漿中HMGB1水平

3.6抗HMGB1小鼠的血漿和肝組織中HMGB1的表達:抗HMGB1組小鼠和甘草素處理組小鼠的血漿和肝組織HMGB1較模型組降低(P<0.01)。HMGB1處理逆轉了甘草素對HMGB1的抑制作用(P<0.01)。見圖5。

圖5 HMGB1在血漿和肝組織中的表達

3.7HMGB1在造血干細胞移植后肝損傷中的作用：抗HMGB1組小鼠和甘草素處理組小鼠的血漿ALT、AST和TBIL水平較模型組顯著降低(P<0.01)。HMGB1處理逆轉了甘草素對ALT、AST和TBIL水平的抑制作用(P<0.05)。抗HMGB1組小鼠和甘草素處理組小鼠的肝組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達顯著低于模型組(P<0.01)。HMGB1處理小鼠逆轉了甘草素對TNF-α、IL-6和IL-1β表達的抑制作用(P<0.05)。見圖6。

圖6 HMGB1在造血干細胞移植后肝損傷中的作用

4 討 論

肝臟損傷是造血干細胞移植后的重要并發癥之一。研究表明，炎性相關因子在肝臟損傷的發生發展中起著重要作用，與肝損傷的程度有密切關系[10]。張景豪等[11]研究表明肝損傷時肝組織內存在明顯的炎性細胞的浸潤及肝細胞變性壞死，經治療肝損傷減輕時觀察到肝組織內炎性細胞浸潤情況明顯好轉。本研究以C57BL/6小鼠為供鼠，BALB/C小鼠為受鼠建立造血干細胞移植后肝損傷模型。結果顯示，移植后小鼠肝小葉正常結構受損，肝細胞排列紊亂，胞質內出現空泡，胞核固縮甚至壞死，出現炎性細胞浸潤。同樣地，對肝組織中炎性因子的檢測也說明移植后小鼠炎癥水平明顯升高。而經甘草素灌胃處理后，小鼠肝組織病理改變好轉，肝小葉結構部分恢復，肝細胞壞死減輕，炎癥細胞浸潤減少。以上研究結果說明甘草素具有優良的抗炎活性，可以緩解造血干細胞移植后肝損傷。

甘草的主要化學成分以三萜類皂苷和黃酮類為主。三萜類皂苷，如甘草酸及甘草酸二銨等具有明顯的抗炎活性。黃酮類，包括甘草素、異甘草素和甘草苷等也表現出明顯的抗炎活性。說明甘草中的三萜類皂苷和黃酮類物質在抗炎中均表現出巨大的潛力。而有研究發現甘草素是高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的抑制劑，可以直接與細胞外的HMGB1結合，減少其與下游信號的作用，并且可以反過來減少HMGB1的主動分泌[12]。HMGB1是HMG蛋白超家族中的一員，是一種保守的非組蛋白核蛋白，廣泛分布于淋巴、肝、腦、肺、心等組織中，由215個氨基酸組成，分子量在25～30kDa之間[13]。以往研究表明，HMGBl在多種疾病的發生發展中起重要作用，如肝缺血再灌注損傷[14]等。黃鎮林[15]的研究表明：在肝損傷小鼠模型中，血清HMGB1水平明顯升高，而甘草素和甘草苷可減少血清HMGB1水平。本研究使用甘草素和抗HMGB1抗體處理小鼠可降低血漿及肝組織中HMGB1表達，并緩解造血干細胞移植后的肝損傷，而腹腔注射HMGB1逆轉了甘草素對肝損傷的緩解作用，說明HMGB1對造血干細胞移植后肝損傷有促進作用，且甘草素可以通過抑制HMGB1的表達緩解造血干細胞移植后肝損傷。

在本研究中，模型組小鼠血漿HMGBl水平顯著升高，經甘草素處理后血漿HMGB1顯著降低；免疫組化法檢測結果顯示，造血干細胞移植后可見胞漿內褐色顆粒即HMGB1顯著增加，甚至形成褐色片狀；經甘草素處理后，肝組織中褐色顆粒明顯變少，即HMGB1含量降低；肝組織中HMGB1 mRNA的表達也顯示出同樣的趨勢?？笻MGB1抗體處理緩解造血干細胞移植后肝損傷，而HMGB1處理可逆轉甘草素對造血干細胞移植后肝損傷的緩解作用。綜上所述，本研究探索了HMGB1在造血干細胞移植后肝損傷中的表達情況，并初步明確HMGB1對造血干細胞移植后肝損傷的促進作用，明確了甘草素可以通過抑制HMGB1的表達緩解造血干細胞移植后肝損傷，為造血干細胞移植后肝損傷的臨床治療提供新的思路。