D3胚胎形態(tài)學評分對單囊胚凍融移植周期臨床結局的影響

方璐，黃亞，徐杰，祁秀娟

(上海永遠幸婦科醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，上海 200131)

輔助生殖技術(ART)發(fā)展40年來，隨著臨床促排卵方案的優(yōu)化和胚胎培養(yǎng)技術的提高，囊胚的移植成功率顯著升高，但在 IVF-ET治療過程中僅有50%～60%的胚胎被利用，這是由于一些D3胚胎因為胚胎評分低而被丟棄[1]。臨床常常面臨患者因無法獲得優(yōu)質D3胚胎而導致ART治療失敗的困擾。因此，如何合理利用已獲胚胎，縮短治療時間、提高累計妊娠率是生殖醫(yī)生共同關注的問題。有研究發(fā)現，將非優(yōu)質D3胚胎在體外進行囊胚培養(yǎng)，玻璃化冷凍復蘇后再進行移植，盡管囊胚形成率較低，但仍有成功分娩健康嬰兒的病例報道[2-3]。Stecher等[4]通過延時成像觀察到一些質量較差的D3胚胎在培養(yǎng)成囊胚后移植可獲得活產分娩。以上研究表明，即使評分低的D3胚胎在囊胚培養(yǎng)過程中仍有可能表現出較好的發(fā)育潛能。

本研究回顧性分析了2017年4月至2020年1月在本院生殖中心行凍融單囊胚移植的699個周期的臨床資料，探討不同評分的D3胚胎進行囊胚培養(yǎng)后再行單囊胚凍融胚胎移植的妊娠結局，旨在為胚胎培養(yǎng)和單囊胚胎移植提供臨床依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017年4月至2020年1月在本院生殖中心行凍融單囊胚移植患者的臨床資料。

納入標準：18 kg/m2≤體質量指數(BMI)≤30 kg/m2，行凍融單囊胚移植的患者。

排除標準：≥45歲；合并子宮畸形、嚴重子宮腺肌癥或者伴有其它子宮器質性病變。

本研究共納入699個移植周期。根據不同囊胚來源的D3胚胎形態(tài)學評分分為兩組：D3胚胎為非優(yōu)質胚胎者(D3非優(yōu)胚組，n=492)；D3胚胎為優(yōu)質胚胎者(D3優(yōu)胚組，n=207)。

二、研究方法

1.促排卵方案：根據女方年齡和卵巢儲備功能選擇適當的促排卵方案，包括微刺激促排卵方案、高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS)、拮抗劑方案等。于扳機后35～37 h經陰道超聲引導下穿刺取卵。授精方式以手術當天男方精液情況決定。

2.囊胚培養(yǎng)及評分：應用卵裂胚胎培養(yǎng)液(Sage，美國)和囊胚培養(yǎng)液(Kitazato，日本)進行序貫培養(yǎng)，將D3胚胎轉移至囊胚培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第5、6、7天。

根據D3胚胎形態(tài)學標準[5]進行評分，分為Ⅰ級(7～9個細胞，卵裂球大小均勻，碎片<10%，無空泡)、Ⅱ級(6～10個細胞，卵裂球大小基本均勻，碎片10%～20%，無空泡)、Ⅲ級(>4個細胞，卵裂球大小不均勻或有少量空泡，碎片為20%～50%)和Ⅳ級(<4個細胞，卵裂球明顯不均勻，有大量空泡，碎片>50%)。其中D3發(fā)育到6～10個細胞的Ⅰ、Ⅱ級胚胎定義為優(yōu)質胚胎，D3發(fā)育為2～10個細胞的Ⅲ、Ⅳ級和>10個細胞Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級胚胎定義為非優(yōu)胚胎。

囊胚評分采用Gardner評分標準[6]，其中AA、AB、BA囊胚為優(yōu)質囊胚；D5囊胚或D6囊胚直徑≥16 mm或D7囊胚直徑≥18 mm視為可凍存的囊胚。所有囊胚移植前均進行激光輔助孵化。

3.囊胚玻璃化冷凍和解凍：將囊胚放入玻璃化冷凍試劑盒(VTl01，Kitazato，日本)的平衡液(ES)中平衡8～15 min，然后將平衡后的囊胚移入玻璃化冷凍液(VS)中放置60～90 s，隨后將囊胚迅速裝入冷凍載桿放入液氮中。囊胚解凍時，將載桿上的胚胎轉移到玻璃化解凍試劑盒(VTl02，Kitazato，日本)的解凍液(TS)中，37℃放置1 min，然后轉移到稀釋液(DS)中，25℃放置3 min，再轉移到清洗液(WS)中放置5 min，清洗2次，最后將胚胎在培養(yǎng)基(Art-1029，Sage，美國)中清洗2次，立即用倒置顯微鏡(IX-73，Olympus，日本)觀察胚胎解凍3 h后的擴張情況。

4.內膜準備方案：對于月經規(guī)律的患者采用自然周期準備內膜，排卵前注射HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)5 000 U，監(jiān)測到排卵后口服地屈孕酮片(達芙通，蘇威制藥，荷蘭)10 mg，3次/d，5 d后進行囊胚移植。對于無規(guī)律月經周期的患者采用激素替代周期準備內膜，月經第3天開始，口服雌二醇地屈孕酮片(芬嗎通，蘇威制藥，荷蘭)紅片4 mg，2次/d，連續(xù)服用10 d，根據患者的內膜情況調整用藥劑量，當子宮內膜厚度≥8 mm時，改為口服芬嗎通(蘇威制藥，荷蘭)黃片4 mg，2次/d，同時陰道給藥黃體酮軟膠囊(安琪坦，Besins Manufacturing，比利時)200 mg，2次/d，連續(xù)服用10 d。黃體支持第6天在陰道超聲引導下行胚胎移植，每周期移植1枚復蘇囊胚，移植后繼續(xù)黃體支持。

5.妊娠結局判定：囊胚移植后10 d檢測血β-HCG，β-HCG≥25 U/L為HCG陽性；移植后28 d行陰道超聲檢查，子宮腔內可見孕囊為臨床妊娠；妊娠≥28周的活產嬰兒定義為活產。

6.觀察指標：比較兩組患者的活產率、HCG陽性率、臨床妊娠率、流產率。活產率=活產分娩周期數/移植周期總數×100%；HCG陽性率=HCG陽性周期數/移植周期數×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數×100%。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、患者一般資料比較

本研究共納入699個單囊胚凍融移植周期，根據囊胚來源的D3胚胎形態(tài)學評分分為D3非優(yōu)胚組(n=492)和D3優(yōu)胚組(n=207)。兩組間平均年齡、BMI、不孕類型、促排卵方案、受精方式和子宮內膜準備方法比較均無顯著差異(P>0.05)；D3優(yōu)胚組的D5、D7囊胚形成與D3非優(yōu)胚組比較均無顯著差異(P>0.05)，而D3優(yōu)胚組的D6囊胚形成顯著低于D3非優(yōu)胚組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組來源囊胚的囊胚移植妊娠結局比較

D3優(yōu)胚組來源囊胚的優(yōu)質囊胚率、臨床妊娠率和活產率均顯著高于D3非優(yōu)胚組來源囊胚(P<0.05)，兩組間HCG陽性率和流產率比較均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組來源囊胚的凍融移植結局比較(%)

三、不同囊胚形成時間組中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結局比較

根據不同囊胚形成時間分為3個亞組：D5囊胚組、D6囊胚組和D7囊胚組，比較各亞組中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結局。

D5囊胚組的HCG陽性率、臨床妊娠率和活產率均顯著高于D6囊胚組和D7囊胚組(P<0.05)；D5囊胚組、D6囊胚組和D7囊胚組中來源于D3優(yōu)胚組的囊胚移植活產率均高于來源于D3非優(yōu)胚組的囊胚，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；D6、D7囊胚組中來源于D3非優(yōu)胚組的囊胚移植流產率均顯著高于來源于D3優(yōu)胚組囊胚(P<0.05)(表3)。

表3 不同形成囊胚時間優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的妊娠結局比較[n(%)]

四、不同年齡段來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的單囊胚移植妊娠結局比較

根據患者不同年齡分為3個年齡段：<35歲組、35～40歲組和≥40歲組，比較不同年齡段中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結局。

與≥40歲組比較，<35歲組和35～39歲組HCG陽性率、臨床妊娠率和活產率均顯著升高(P<0.05)；相同年齡段患者中，來源于D3優(yōu)胚組的囊胚活產率均高于來源于D3非優(yōu)胚組囊胚，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 不同年齡段中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結局比較[n(%)]

討 論

胚胎質量是ART成功的關鍵因素。優(yōu)先移植優(yōu)質的胚胎可以提高妊娠率和活產率，減少流產率和產前并發(fā)癥、縮短治療時間。但是，對于沒有優(yōu)質D3胚胎的患者，是否選擇評分差的D3胚胎來源的囊胚進行移植以縮短IVF治療周期是困擾生殖醫(yī)生的難題。

囊胚質量與卵裂期胚胎的質量高度相關。優(yōu)質的卵裂期胚胎可以形成數量更多、質量更好、發(fā)育更快的囊胚，移植后的臨床妊娠率和活產率更高。本研究發(fā)現，D3優(yōu)胚組的優(yōu)質囊胚率以及所形成囊胚移植后的臨床妊娠率、活產率均顯著高于D3非優(yōu)胚組(P<0.05)，本研究結果與黃柳靜等[7]研究結果一致。但也有研究者提出，囊胚形成率與D3胚胎的質量相關，而所形成的囊胚質量與D3胚胎質量無關。據研究推測，在D3胚胎向囊胚發(fā)育的過程中，隨著胚胎基因組的激活，基因和代謝缺陷的胚胎將被自然淘汰，一部分胚胎似乎可以自我修復并最終發(fā)育成囊胚[1，8]。在本研究中，來源于D3非優(yōu)胚組的胚胎仍有25.81%最終形成優(yōu)質囊胚，盡管所形成囊胚的凍融移植活產率低于來源于D3優(yōu)胚組所形成的囊胚，但移植后活產率仍可達到33.13%，這可能與胚胎的自我修復功能有關。

目前，大多數胚胎實驗室采用卵裂期胚胎評分，通過靜態(tài)的胚胎形態(tài)學觀察對胚胎的質量進行評估[9]。分裂對稱、碎片率低(<10%)、大小均勻、單核、具有均勻透明細胞質的胚胎常被評為卵裂期優(yōu)質胚胎[10]。形態(tài)學觀察操作簡便、評估效率高，因此，受到臨床醫(yī)生的推崇。但是，該方法受評估者主觀經驗影響較大，而且只能反映出某些特定時間點的胚胎狀態(tài)，不能準確評估胚胎的發(fā)育潛能[11]。有研究表明，評分差的卵裂期胚胎可以在體外培養(yǎng)到囊胚階段，然后玻璃化冷凍復蘇后進行移植，仍有可能成功分娩健康的嬰兒[2]。黃柳靜等[7]研究發(fā)現，對評分差的D3胚胎進行囊胚培養(yǎng)后移植的活產率可達26.7%。本研究發(fā)現，來源于非優(yōu)胚組的囊胚凍融移植活產率為33.13%。因此，對于沒有優(yōu)質D3胚胎的患者，可進行囊胚培養(yǎng)，增加體外培養(yǎng)時間進而挑選出發(fā)育潛能較好的胚胎，再進行囊胚移植仍可獲得較好的臨床結局，可以最大限度地利用胚胎[6，12]。但是，也有研究發(fā)現，非優(yōu)質卵裂胚所形成的囊胚移植后流產率顯著高于優(yōu)質卵裂胚[13]。本研究發(fā)現，來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚凍融移植后的流產率比較并無顯著差異，且流產率均低于20%。確切的機制不明，也可能與實驗室采用的胚胎培養(yǎng)體系相關。

囊胚發(fā)育速度是影響ART妊娠結局的一個重要因素。D5與D6囊胚移植后臨床妊娠結局是否有顯著差異目前仍存在爭議。有研究報道，在鮮胚移植周期中，D5囊胚移植的臨床妊娠率高于D6囊胚，但是，在復蘇周期中D5、D6囊胚移植后的臨床妊娠率比較并無顯著差異[14-15]，這可能與新鮮周期中D6囊胚與子宮內膜發(fā)育不同步有關。大多數研究顯示，D5囊胚的復蘇率、種植率及活產率均顯著高于D6囊胚[16-18]；在行囊胚培養(yǎng)的D3胚評分相同的情況下，所形成的D5囊胚移植后的活產率仍高于D6囊胚[19]。本研究顯示，在凍融單囊胚移植周期中，D5囊胚組的HCG陽性率、臨床妊娠率和活產率均顯著高于D6囊胚組和D7囊胚組(P<0.05)。由于大多數研究中移植的囊胚未進行胚胎移植前遺傳學篩查(Pre-implantation Genetic Screening，PGS)，發(fā)育緩慢的囊胚有較高的染色體異常發(fā)生率，所以D6囊胚組非整倍體的發(fā)生率可能高于D5囊胚組[20]，從而增加了D6囊胚組早期流產率。Hashimoto等[21]研究發(fā)現，發(fā)育較遲緩的D6囊胚會增加異常紡錘體的發(fā)生率，并降低玻璃化冷凍后胚胎的種植率；D5囊胚移植結局優(yōu)于D6囊胚的內在原因之一，可能是D5囊胚細胞DNA對于冷凍過程的抵抗力更強。然而，一項Meta分析發(fā)現，移植玻璃化冷凍復蘇胚胎的妊娠結局很大程度上取決于子宮內膜的同步性，若D5和D6囊胚具有相近的囊胚評分，則凍融單囊胚移植能獲得相似的妊娠結局[22]。Yang等[23]的研究結果也支持這一結論。

年齡是影響ART妊娠結局的另一個獨立因素。本研究發(fā)現，無論在所移植的囊胚是來源于D3非優(yōu)胚組還是D3優(yōu)胚組，年齡<35歲組的臨床妊娠率和活產率最高，其次是35～39歲組，年齡≥40歲組最低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與既往研究報道[24]一致。而且，在相同年齡段中，來源于D3非優(yōu)胚組和優(yōu)胚組的囊胚移植活產率比較并無顯著差異(P>0.05)。年齡是影響活產率的獨立因素[25]，隨著患者年齡的增加，胚胎的非整倍體率增加10%[26]，這也是高齡(≥40歲)患者IVF周期胚胎種植失敗和流產的主要原因。

在大多數生殖中心中，常常選擇D5或D6囊胚進行移植或冷凍，而對于發(fā)育緩慢者如D7囊胚給予丟棄處理。因為D7囊胚形成率低，而且冷凍過程將進一步損傷囊胚細胞，增加DNA碎片、促進凋亡基因轉錄，從而降低了冷凍囊胚發(fā)育潛能[27]。因此，對于D7囊胚的冷凍價值仍然存在爭議。有研究發(fā)現，D7囊胚移植后的臨床妊娠率為6.2%～42.9%[28]。本研究中，D7囊胚的臨床妊娠率達到32.26%，活產率達到22.58%，即使來源于D3非優(yōu)胚組的D7囊胚活產率也可達20.00%。需要強調的是，本中心對D7形成的囊胚直徑≥18 mm才予以冷凍保存，對于未達到標準的囊胚仍然給予丟棄處理，從而提高了D7囊胚移植的臨床妊娠率[29]。盡管D7囊胚僅占可用囊胚的5%，但是通過延長培養(yǎng)時間可以增加可用囊胚的數量，提高每個周期的可用胚胎數，從而提高取卵周期的累計妊娠率，特別是對于無優(yōu)質D3胚胎的患者，進行囊胚培養(yǎng)后仍可獲得一定的活產率[30]。但是，由于本研究中D7囊胚樣本量較少，可能影響統(tǒng)計學分析結果，后期需要進一步擴大樣本量進行驗證。

綜上所述，建議優(yōu)先選用來源于優(yōu)質D3胚胎的囊胚進行移植；對于評分差的D3胚胎延長培養(yǎng)至囊胚后，優(yōu)先選擇發(fā)育快的囊胚進行移植仍可獲得良好的妊娠結局；對于D7囊胚仍有22.58%的活產率。因此，對于評分差的D3胚胎可培養(yǎng)至囊胚后再行凍融胚胎移植，不應當輕易丟棄D7囊胚，如此可以提高取卵周期的累計妊娠率和胚胎利用率，縮短患者獲得臨床妊娠的時間，減少患者的經濟負擔和心理負擔。