表沒食子兒茶素沒食子酸酯對雌性生殖系統作用的研究進展

郭燕潔，方蘭蘭，孫瑩璞

(鄭州大學第一附屬醫院生殖與遺傳專科醫院，鄭州 450052)

綠茶是一種未經發酵的茶，其生物活性有效成分主要為多酚類化合物——茶多酚[1]，綠茶中酚類物質中80%為類黃酮化合物，而類黃酮類物主要成分為兒茶素。四種主要的茶多酚被命名為兒茶素，包括表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素(epicatechin，EC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)等幾種單體[2]。近年，綠茶有效成分的益處被廣泛地研究。EGCG是生物活性最高的一類兒茶素，在綠茶中含量最高。EGCG具有抗病毒、抗氧化、促凋亡及代謝、調節內分泌和血管生成活性等特性。由于這些功能，EGCG可以減少心血管疾病和炎癥疾病的發病率、減輕糖尿病、降低血膽固醇水平以及減輕癌癥等疾病的發生發展[3-5]。EGCG作為無毒的天然產物，在生殖領域也被廣泛地研究。研究發現其在提高配子抗氧化能力、改善胚胎質量、調控類固醇激素合成以及在抗生殖系統腫瘤等相關疾病中都有一定作用[6-8]。本文就兒茶素EGCG的生物學特性以及其對雌性生殖健康的研究進展進行了總結，以期加深對于EGCG在生殖系統中的作用的認識與理解。

一、EGCG分子特性及主要功能

(一)EGCG的分子特性

兒茶素EGCG化學分子式為C22H18O11，其分子量為458.4。經典的EGCG提取分離及單體制備工藝有膜分離法、樹脂法、金屬離子沉淀法、超聲波輔助萃取法等。制備兒茶素中EGCG單體時，需要進一步經過高效液相色譜法或柱色譜法純化[9]。EGCG結構中具有6個鄰酚羥基和一對間羥基基團，眾多的酚羥基使得EGCG具有許多優于其他兒茶素的性質[10]。4種包括EGCG在內的主要的兒茶素及結構如圖1所示。目前已知的 EGCG 受體為67 KDa的層粘連蛋白受體(67 KDa laminin receptor，67LR)，被發現只能特異性結合EGCG，而其他的兒茶素如EC、ECG、EGC則不能結合此受體[11]。在生殖系統中，EGCG受體的67LR已經在人卵巢癌細胞系OVCAR-3、人乳突狀卵巢腺癌細胞Caov-3、卵巢腺癌細胞系SKOV3等細胞中證實其存在[12]。

A：EGC；B：EC；C：ECG；D：EGCG。抗氧化和去除晚期糖基化終末產物的活性酚羥基苯環用藍色高亮顯示，4種化合物差異的烴基基團用紅色顯示圖1 綠茶中的4種兒茶素結構式

(二)EGCG的生物活性作用

現有研究表明，茶多酚EGCG具有降血壓、降血糖、降血脂、預防心腦血管疾病、抑制腫瘤發生發展等多種藥理活性[13]，其抗氧化和抗腫瘤作用在人體被廣泛研究。

1.抗氧化功效：綠茶被認為是抗氧化劑的飲食來源，綠茶中EGCG 抗氧化的能力較為突出，使其成為明星生物活性物質。EGCG可以通過減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)、清除自由基實現抗氧化的功效[14]。綠茶中也包含很多其他物質，例如維生素C、類胡蘿卜素和維生素E、礦物質以及普遍的植物化學成分，這些成分可能會提高EGCG的抗氧化性[15]。

EGCG有高于維生素C的清除自由基、抗氧化作用[16]，在體內充當自由基的清道夫，可以保護生殖細胞對抗氧化應激(oxidative stress，OS)[17]。其抗氧化功效主要通過以下4個機制發揮作用：(1)螯合金屬離子：EGCG具有鄰苯二酚結構，因此具有很強的金屬離子螯合能力，能結合Haber-Weiss和Fenton反應中的鐵離子和游離鐵，從而降低其含量[18]；(2)結合自由基：羥自由基和超氧陰離子自由基可引起細胞內脂質過氧化反應，進而引起細胞損傷。而EGCG具有這兩種自由基的強結合力，通過掃除自由基而降低細胞的氧化應激[18]；(3)調節轉錄因子或酶活性：EGCG在體內可以通過影響轉錄因子或酶的活性來間接發揮抗氧化作用，如通過氧化還原調節的轉錄因子調控以及增強谷胱甘肽-S-轉移酶的活性等[19]；(4)調控酶活性/清除氧化中間產物：EGCG在體內還能通過調控酶的活性來發揮抗氧化作用，如基于絲裂原激活的蛋白激酶的細胞周期的調節[20]。在細胞內，EGCG 具有清除氧化中間產物的能力，參與到包括AKT/mTOR通路、MRLC 通路、RANK通路、TLR2/3通路、ERK1/2通路等眾多分子通路中[21-22]。

2.抗腫瘤作用：EGCG 還具有廣泛的抗腫瘤作用，被證實在卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、胃癌等腫瘤中，可以抑制細胞的生長、增殖，并減少遷移和侵襲，提高體內抗腫瘤的免疫力，從而抑制腫瘤的發生發展[23]。而在眾多腫瘤模型研究中，應用5 μmol/L至200 μmol/L的EGCG處理腫瘤細胞或組織，發現往往是較低濃度的EGCG處理可以起到抗腫瘤效果[23]。乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，體外實驗證明EGCG可以阻礙細胞周期、抑制細胞增殖和分化；能夠通過調控VEGF的表達抑制血管生成，誘導細胞凋亡；還可以抑制有害物的致癌發生率，降低已形成腫瘤的大小、數目及腫瘤細胞的侵襲和轉移[24]。

(三)EGCG的代謝

關于綠茶保健功能的研究主要是在體外實驗，對其代謝特性的研究主要集中在體外的生物活性測定。目前對于EGCG體內生物轉化的研究尚淺，深入探討EGCG的生物利用度有助于明確其作用效果和機制。目前的研究結果顯示，EGCG在pH 7.4的條件下進行體外轉化時半衰期為0.56 h。加入金屬螯合劑和二乙基三胺五乙酸能夠延長其半衰期，三價鐵離子能加速其降解，這是因為 EGCG在溶液中可以結合金屬離子[25]。EGCG具有生物穩定性低、生物轉化率高、代謝率不穩定的特性。現有研究表明胃部和腸道的極端條件以及相關消化酶會導致EGCG發生降解或者聚合反應。兒茶素主要通過被動擴散(包括細胞旁擴散和跨細胞擴散)通過腸上皮轉運，而目前小腸上皮細胞表面沒有發現可以轉運進入細胞的特異性受體[26]，這是EGCG吸收率低的主要原因；部分吸收的兒茶素的主動外排也降低了血漿兒茶素濃度。

二、EGCG在生殖系統的作用和功能

1.EGCG與卵母細胞成熟：導致不孕的因素眾多，其中營養缺乏、農藥和工業化學品主動和被動攝取、吸煙、過度飲酒等，可以通過增加氧化應激的方式破壞卵子的質量[27]。放射線或尿路感染等因素也會影響女性生育能力，當ROS的產生超過人體的抗氧化能力時，就會發生氧化應激。此時氧化應激會引發脂質氧化，從而破壞膜的完整性并增加其滲透性，造成細胞中酶的失活，導致DNA結構損傷和細胞凋亡，從而抑制卵母細胞的發生與成熟[28]。卵母細胞成功受精的關鍵在于卵母細胞的成熟，卵母細胞不成熟最終會導致生育力下降。探究EGCG分子在女性生殖系統的抗氧化作用調控機制，有助于改善卵子抗氧化能力，提高卵母細胞成熟率，為提高女性生育相關疾病提供新的診療策略。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是哺乳動物中含巰基的多肽成分，有保護細胞抵抗氧化性損傷的功能，也是卵母細胞活性和發育潛能的潛在標記物。有研究發現加入更多ROS后，卵母細胞中谷胱甘肽含量減少，同時卵母細胞成熟受到抑制[29]。Wang等[30]在牛卵母細胞從GV期至MⅡ期體外培養過程中加入不同濃度EGCG進行處理，發現加入15～20 μmol/L EGCG能夠明顯提高卵母細胞中GSH含量，從而降低細胞內ROS的積累，進而提高受精后胚胎的囊胚形成率。然而過低(<10 μmol/L)或過高濃度(>25 μmol/L)EGCG處理體外成熟培養(IVM)的卵母細胞時，卵母細胞GSH含量雖高于對照組，但無顯著差異，對卵母細胞成熟無顯著改善作用。這說明只有適當濃度EGCG可以促進牛卵母細胞體外成熟與卵泡發育。

外源應激會通過增加氧化應激從而影響卵母細胞的功能，如高熱會破壞卵母細胞的完整性，而一定濃度的EGCG可以抵抗熱應激，從而促進卵母細胞的成熟。在雌性小鼠體內注射EGCG(100 mg/kg)后，分別暴露在22℃和40℃的環境中，可以有效改善體外成熟卵母細胞的發育，由優質卵母細胞發育而來的胚胎質量也有所提高[31]。

此外，農藥成分甲基對硫磷(methyl parathion，MP)的殘留會破壞卵子質量，其方式是通過增加氧化應激降低核成熟率，造成內質網、線粒體組分改變和紡錘體分布異常，進而引起細胞質成分紊亂。研究表明，Swiss albino鼠卵母細胞體外成熟培養過程中加入0.25 μmol/L EGCG，可以通過緩解卵母細胞氧化應激和內質網應激水平，提高核成熟率、減輕胞質成分紊亂，從而減輕MP(100 μg/ml)對卵母細胞的毒性作用，改善MP所致的卵子成熟障礙[32]。

以上研究表明，EGCG可提高卵子生理和病理狀態下對抗氧化應激的能力，有效降低外界氧化應激與內質網應激損傷的程度。

綜上所述，兒茶素EGCG對卵母細胞的發育和成熟調控有物種差異性和濃度差異性，EGCG在哺乳動物間具有提高卵母細胞抗氧化應激能力與促進成熟的潛力，可以更進一步提高受精率與胚胎發育能力。

2.EGCG與胚胎發育：胚胎在體外培養時，不受母源抗氧化活性物質的保護，其抗氧化活性相較于在體內更低，在此環境中產生的氧自由基可能抑制胚胎的成熟，需要增加抗氧化劑以提高體外培養的胚胎質量[33]。綠茶中的兒茶素EGCG有提高哺乳動物的配子質量和體外受精成功率的潛力[34]。Ahmed等[35]的研究表明EGCG可作為胚胎凍存液中提高抗氧化應激能力的抗氧化劑。

近期有研究報道了EGCG對小鼠受精情況和胚胎發育的影響。在體外培養卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complex，COCs)的模型中，添加20 μmol/L的EGCG時發現小鼠成熟卵母細胞COCs內GSH濃度顯著提高，并提高了卵母細胞受精率和胚胎發育率[36]。另有研究在小鼠裸卵細胞培養基中加入不同濃度的EGCG，測量GSH濃度和卵母細胞成熟率、受精率和二細胞發育率。結果顯示，隨著兒茶素EGCG濃度的增加，卵母細胞成熟率沒有明顯變化，但可以提高胚胎受精率和二細胞的發育率[37]。這是因為在裸卵培養過程中，由于缺乏顆粒細胞，EGCG不能通過顆粒細胞增加細胞內GSH濃度，故經過EGCG處理后對胚胎的發育影響不大。

此外，Spinaci等[38]研究表明，EGCG對胚胎質量的影響具有濃度差異性。在IVM和IVF過程中，加入 0、5、15、20 μg/ml的EGCG對豬胚胎的發育能力沒有明顯影響，但25 μg/ml劑量的EGCG對豬孤雌生殖胚胎的體外發育有抑制作用，其發育到囊胚的數量有所下降。Li等[39]在IVM培養基中加入不同濃度 EGCG，在加入10 μg/ml EGCG 后，體外激活的豬胚胎中ROS水平較其他組顯著降低，而使用50 μg/ml EGCG處理后培養出的囊胚，每個克隆囊胚的細胞總數低于其他各對照組(P<0.05)，表明體外培養中過量EGCG可能對胚胎發育造成損傷，同時體細胞核移植胚胎的質量下降，這顯示了EGCG對豬克隆胚胎的體外發育可能有負效應。

因此，兒茶素EGCG可以保護哺乳動物胚胎發育過程中免于氧化作用的影響，提高胚胎受精率和胚胎發育率。但是過量的EGCG可能會對胚胎的發育有促進細胞凋亡的作用，引起負性毒性作用，從而影響胚胎發育。

3.EGCG參與類固醇激素合成及卵泡發育：類固醇激素在卵泡生長發育的過程中起著不可或缺的作用，在女性不孕癥的眾多發病原因中，類固醇甾體激素生成障礙及其引起的卵泡發育障礙是女性不孕的主要原因[40-41]。卵泡發育是在顆粒細胞與卵母細胞的相互作用下進行的，卵泡的正常發育離不開顆粒細胞的分泌作用，而激素分泌異常會造成卵泡發育停滯或卵泡過度消耗，同時也會進一步加劇機體內分泌紊亂。性激素中雌二醇、孕酮和睪酮均屬于類固醇甾體激素。研究發現兒茶素EGCG可以調控類固醇激素生成和卵泡的發育，研究EGCG對類固醇激素的調控對女性生殖健康具有重要意義。

有研究討論了兒茶素EGCG處理豬原代顆粒細胞對類固醇激素生成的影響。使用不同濃度EGCG處理豬原代顆粒細胞48 h后，檢測培養基中孕酮和睪酮的濃度，發現10 μg/ml EGCG處理顆粒細胞后，產生的孕酮較對照組升高2倍左右，而在較低或更高濃度EGCG處理后則沒有顯著差異；同時，在1 μg/ml EGCG處理顆粒細胞后，其睪酮輸出總量升高[42]。另有研究發現，經過EGCG處理48 h的豬卵母細胞，檢測到卵丘細胞中胰島素樣生長因子和孕酮水平降低[37]。

此外，EGCG具有促進雌性家兔卵巢細胞凋亡和調控類固醇激素生成的作用。在雌性家兔模型的體外實驗中，分別使用不同濃度EGCG處理家兔的卵巢組織，發現在低濃度EGCG(1 μg/ml)處理時，孕酮和睪酮的濃度均升高，而較高濃度EGCG(10 μg/ml、100 μg/ml)處理家兔卵巢組織時，孕酮和睪酮的濃度則會降低，而細胞的凋亡均增多；體內實驗證實，用常規和添加兩種含量綠茶的飼料喂養家兔到成年后，較高濃度綠茶飼養的家兔受孕率降低，且成熟卵泡排卵受到抑制，證實EGCG可以降低家兔的卵巢功能和繁殖力[43]。

類固醇激素雄烯二酮是雌酮和睪酮的前體物質，在絕經后中國女性的一項研究中，每周各天均飲用綠茶的女性，其血漿中雌酮、雌二醇和雄烯二酮激素均高于對照組女性(每周飲用綠茶小于1次)[44]。

以上研究結果表明，EGCG對類固醇激素的生成有調控作用，但其作用有濃度依賴性，不同濃度的作用效果不相一致。

三、臨床轉化與挑戰

為了提高兒茶素尤其是EGCG的生物活性，一些技術被開發出來，如基于納米結構的藥物傳遞系統、分子修飾和兒茶素的聯合給藥等[45]。將EGCG包裹在蛋白質、碳水化合物和脂質基納米顆粒上可以提高EGCG的穩定性和胞膜滲透性，并使其得到持續釋放，從而提高兒茶素的生物利用度。應用分子修飾的方法，如合成過氧乙酰化可保護羥基免受氧化降解，直至其被細胞內的酯酶脫乙酰化[46]，減少EGCG的生物轉化和流失。此外，將EGCG適當與其他藥物或生物活性物質共同施用，通過EGCG與所選藥物的相互作用產生協同效應，可以提高吸收率和抑制細胞轉運體的外排作用[47]。

研究兒茶素EGCG的生物利用度還有很大的發展空間。目前研究顯示，EGCG作用的疾病靶向性和多分子靶向性有望得到改善，從而找到更有效、更穩定和特異性的EGCG活性制劑[47-48]。在改善卵子和胚胎質量、降低氧化應激方面，或可應用持續低劑量EGCG方案進行治療；在生殖系統腫瘤的治療中，有希望采用EGCG的靶向給藥和快速釋放高劑量方法治療疾病。目前文獻中的證據尚不支持EGCG作為臨床試驗藥物在女性不孕癥中的應用，這些改進技術的有效性需要進一步的臨床驗證。

四、結語

多個研究結顯果示，EGCG在雌性生殖力的保護和提高生殖力方面具有良好的應用前景。兒茶素EGCG是天然的無毒性氧化應激清除劑，可以調控卵母細胞發育的各個階段，并參與胚胎發育、激素生成的調控。不同劑量的EGCG有不同的作用效果，在針對不同生殖系統功能的治療時需要選用最佳劑量。有研究證實，一杯200 ml的普通綠茶中大約含有140 mg的EGCG，每日適當飲茶即可以補充一定量的EGCG[49]。在日常飲食中適當地攝入EGCG，有可能提高女性卵母細胞成熟率，對生育力保護具有一定的積極意義。

綜上所述，EGCG為體外生殖細胞和胚胎培養等臨床應用提供了新方向，對女性生殖系統功能的改善具有良好的應用價值。