高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術診斷羅氏易位患者正常胚胎的臨床應用

王喜良，伍昌勝，郝冬梅，張金艷，檀暢，費嘉，于月新*

(1.中國人民解放軍北部戰區總醫院生殖醫學科，沈陽 110003；2.北京嘉寶仁和醫療科技有限公司，北京 102629)

羅氏易位是人類中較常見的一類染色體結構畸變。羅氏易位攜帶者夫婦在生育時可能面臨反復流產或出生先天缺陷患兒風險。染色體非整倍體篩查技術只能排除染色體不平衡胚胎，不能區分染色體正常胚胎和羅氏易位攜帶胚胎。高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術可以區分胚胎是否攜帶親代的異常染色體，從而診斷出染色體正常的胚胎，幫助患者出生染色體正常的嬰兒。本研究對5對羅氏易位攜帶者夫婦實施了高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術，鑒別出染色體正常胚胎并移植，出生了4個染色體正常嬰兒，現報道如下。

資料與方法

一、研究對象及材料

1.研究對象：2018～2020年因不孕癥或不良妊娠史就診于北部戰區總醫院生殖醫學科，常規核型分析發現一方染色體為羅氏易位而行胚胎植入前遺傳性檢測的患者共30例，其中5對夫婦采用高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術區分羅氏易位攜帶和正常胚胎?；颊呔炇鹬橥鈺?。

2.主要試劑及耗材：胚胎培養液(Cooper Surgical SAGE Media，CooperSurgical，美國)；胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒、胚胎染色體異倍體分析系統(北京中儀康衛醫療器械)；血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)；胚胎植入前單基因病檢測建庫試劑盒(北京中儀康衛醫療器械)。

二、研究方法

1.促排卵、授精及胚胎活檢：采用長方案、改良長方案、拮抗劑方案或高孕激素狀態下促排卵(PPOS)方案促排卵；獲得的成熟卵母細胞采用卵胞漿內單精子注射(ICSI)方式授精；對培養得到的囊胚活檢5～10個滋養層細胞，活檢后的胚胎采用玻璃化方法進行凍存。

2.胚胎植入前非整倍體檢測(PGT-A)：對活檢的滋養層細胞采用PGT-A試劑盒進行全基因組擴增和文庫構建，使用MiSeqDx測序儀進行測序，測序數據使用胚胎染色體異倍體分析系統軟件對染色體拷貝數進行分析。分析方法：測序數據經過質控后，比對到人類參考基因組上，將整個參考基因組分為若干窗口并計算窗口的reads數，然后通過數據校正，結合參考數據集確立的參考范圍使用生物信息學算法進行拷貝數分析。檢測分辨率為4 Mb。

3.胚胎染色體結構鑒定(PGT-SR)：從近端著絲粒染色體的著絲粒附近3 Mb或5 Mb區域(長臂端)內篩選有效的高頻SNP位點作為標記，對父母和易位染色體PGT-A檢測結果異常的胚胎(作為參照)進行連鎖分析，分別構建易位染色體的斷裂點附近區域的單體型；再利用構建好的單體型判斷PGT-A結果正常的胚胎的衍生染色體攜帶狀態(即正?；驍y帶者)。具體操作：以父母外周血DNA和胚胎細胞全基因組擴增產物為模板，對目標區域進行多重 PCR擴增；使用胚胎植入前單基因病檢測建庫試劑盒對多重PCR擴增產物進行文庫構建和MiSeqDx 測序；然后利用生物信息方法選擇該家系中多個有效位點建立連鎖關系。通過2個以上的有效位點的連鎖關系構建單體型。

4.胚胎移植及產前診斷：采用人工周期準備內膜，選擇染色體正常胚胎行復蘇移植。移植后第14天檢測血HCG水平，移植后第28天B超觀察孕囊，妊娠16～18周抽取羊水進行產前診斷。

三、數據處理分析

本研究采用描述性統計。

結 果

一、患者基本資料

5對患者夫婦編號為R1～R5。女方平均年齡28.4歲，主訴包括不良妊娠史后不孕、多年原發不孕和復發流產史。羅氏易位攜帶者核型分別為45，XY，rob(13；14)(q10；q10)、rob(14；15)(q10；q10)和45，XX，rob(13；14)(q10；q10)(表1)。

表1 患者夫婦基本資料

二、患者促排卵周期及胚胎發育情況

5對患者夫婦共促排卵7個周期，采用的促排卵方案包括長方案、改良長方案、拮抗劑方案和PPOS方案。共獲卵200個，平均每周期獲卵28.6個。共獲得成熟卵母細胞176個，平均每周期25.1個，卵母細胞成熟率為88.0%。正常受精數合計140個，平均每周期20個，正常受精率為79.5%。正常卵裂胚合計138個，平均每周期19.7個，正常卵裂率為98.6%。共獲得可用囊胚76個，平均每周期10.9個，可用囊胚生成率為55.1%(表2)。

表2 患者促排卵及胚胎發育情況

三、取卵周期胚胎非整倍體檢測及染色體正常胚胎情況

PGT-A共檢測50個胚胎，其中整倍體胚胎24個，整倍體胚胎比例為48.0%。24個整倍體胚胎中，經多SNP單體型連鎖分析技術診斷，染色體正常胚胎13個，染色體正常胚胎占整倍體胚胎比例為54.2%(表3)。

表3 胚胎非整倍體檢測及染色體正常胚胎情況

5對夫婦的7個周期均獲得染色體正常胚胎。其中，R4-2周期胚胎的PGT-A和PGT-SR結果顯示：胚胎R4-2-01和R4-2-03均為整倍體胚胎，但胚胎R4-2-01單體型與易位攜帶者單體型一致，推斷為易位攜帶者胚胎；胚胎R4-2-03單體型與正常單體型一致，推斷為正常胚胎(圖1，表4)。

A：羅氏易位攜帶者胚胎(R4-2-01)；B：正常胚胎(R4-2-03)圖1 羅氏易位攜帶者(編號R4)PGT-A結果

表4 羅氏易位攜帶者(編號R4)的胚胎單體型分型結果

四、復蘇周期胚胎移植(FET)臨床結局

復蘇移植9個周期，移植9個染色體正常胚胎。臨床妊娠6個周期，早期流產1個周期；出生4個染色體正常嬰兒，另有1例繼續妊娠中，預期可以正?；町a(表5)。

表5 胚胎復蘇移植后臨床結局

討 論

人類有23對46條染色體，染色體的數量、結構相對恒定。不同源的染色體各自發生斷裂后，互相變位重接而形成結構上重排的染色體稱相互易位。羅氏易位是一種特殊類型的相互易位，是兩個具有近端著絲粒的染色體(第13、14、15、21、22號染色體)于著絲點附近斷裂，兩條染色體長臂重接成為易位染色體，短臂丟失，因而羅氏易位攜帶者只有45條染色體。羅氏易位是人類中較常見的一類染色體結構畸變，在人群中發生率約為1.23/1 000[1]。

羅氏易位基本保留了原有基因總數，對基因作用和個體發育無嚴重影響，因此羅氏易位攜帶者本身無表型異常，然而攜帶者在形成生殖細胞時可產生6種類型的配子：1種為染色體正常、1種為羅氏易位攜帶、4種為染色體不平衡。由此可產生3種胚胎類型，不同的胚胎類型有不同的生育風險。第一種是完全正常胚胎(1/6)：正常妊娠，后代無羅氏易位攜帶風險；第二種是羅氏易位攜帶胚胎(1/6)：正常妊娠，后代同樣面臨流產、反復流產或出生先天缺陷患兒風險；第三種是染色體不平衡胚胎(4/6)：導致患者自身流產、反復流產或先天缺陷患兒出生，如13-三體綜合征患兒、21-三體綜合征患兒等。

隨著輔助生殖技術的發展，出現了胚胎植入前遺傳學檢測技術(PGT)，該技術可以在胚胎著床前篩查胚胎染色體非整倍體，從而排除染色體不平衡的胚胎，避免患者不良妊娠的發生。羅氏易位的常見PGT檢測技術有熒光原位雜交(FISH)、微陣列比較基因組雜交(array CGH)、單核苷酸多態性芯片(SNP array)和高通量測序技術(NGS)等。FISH、SNP array、array CGH、NGS均可以診斷胚胎的非整倍性，但FISH受探針數量的限制僅能檢測少數特定染色體的數目異常，不能檢測所有染色體的異常[2]。SNP array和array CGH作為芯片檢測技術，可以檢測整個染色體組的拷貝數異常，但一款芯片的拷貝數變異(CNV)檢測分辨率是固定的，靈活性受限。NGS技術能檢測所有染色體的拷貝數異常，并且檢測分辨率可以通過調整測序深度而進行調整。比如，測序深度為0.01～0.1 X時，檢測分辨率可達4 Mb；測序深度提高到約0.25 X時，分辨率可達到1 Mb。

目前常用技術如FISH、array CGH、SNP array等[3-5]，通過檢測胚胎染色體非整倍體，選擇整倍體胚胎(即平衡型胚胎，包括易位攜帶胚胎和完全正常胚胎)進行植入，幫助患者獲得一個活產的健康孩子，但仍可能將異常(易位)染色體傳遞給子代，不但會導致子代面臨生育問題，對患者本身也是一個長期的心理負擔。因此對平衡型胚胎進一步區分為易位攜帶胚胎和正常胚胎具有重要臨床意義。NGS技術結合SNP單體型連鎖分析技術，既能實現對羅氏易位平衡型胚胎的檢出[6-9]，也能對易位攜帶胚胎和正常胚胎進行區分[10-13]，避免了異常染色體攜帶患兒的出生。有學者分別通過ION PGM測序平臺實現了對1個家系羅氏易位胚胎易位攜帶狀態的分析，但ION PGM測序平臺由于數據量較低以及對連續相同堿基測序準確性較低等不足，實際應用受限[10，13]。陳雯等[12]使用等位基因映射識別技術對羅氏易位胚胎也實現了胚胎易位狀態的判斷，但使用斷裂點上下游1 Mb范圍內選擇SNP位點，可能會因連鎖分析缺乏有效SNP位點而導致胚胎檢測失敗。高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術，采用測序準確性更高的MiSeqDx平臺測序，連鎖分析選擇SNP位點時選取近端著絲粒染色體的著絲粒附近高達3 Mb或5 Mb區域內篩選有效的高頻SNP位點，可以區分胚胎是否攜帶親代的異常染色體，從而診斷出染色體正常的胚胎，幫助患者出生染色體正常的嬰兒。

本研究采用高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術對5對羅氏易位攜帶者夫婦(其中4對為男性羅氏易位攜帶)的胚胎進行了診斷。相關數據為：(1)染色體正常胚胎占整倍體胚胎比例為54.2%，整倍體胚胎占檢測胚胎的比例為48.0%，大致上4個囊胚可以得到一個染色體正常的整倍體胚胎；(2)可用囊胚生成率為55.1%，生成4個囊胚大致上需要8個卵裂期胚胎；(3)正常卵裂率為98.6%，正常受精率為79.6%，卵母細胞成熟率為88.0%，8個卵裂胚胎大致上需要11.6個卵母細胞；(4)移植周期活產率為55.6%(5/9)。因此最終推算下來，患者要獲得一個活產胎兒，需要的卵母細胞數為21.6個。國內患者每個取卵周期平均獲卵數為10～12個[14-15]，因此羅氏易位攜帶者要獲得一個染色體正常胎兒，平均需要取卵2個周期。本研究5對夫婦中，女方均較年輕(平均年齡為28.4歲)，因此3對夫婦僅一次取卵即獲得了染色體正常胚胎并移植成功，并獲得活產嬰兒；第4對夫婦第1周期獲得了兩個染色體正常胚胎，但因為移植后早期流產和未妊娠，而進行了第2個周期的治療；第5對夫婦第1周期獲得了1個染色體正常胎兒，但移植后未妊娠，而進行了第2周期的治療。

有報道女性羅氏易位攜帶者平衡型胚胎發生率較男性攜帶者低[6]，異常胚胎發生率更高[7]，可能與女性攜帶者更難形成對位分離型配子(正?；蛞孜粩y帶者)[16]以及與染色體間相互效應(interchromosomal effect)[17-18]相關。因此女性羅氏易位攜帶者進行 PGT 治療可能需要更多的卵母細胞和治療周期。本研究中僅1例患者為女性羅氏易位攜帶者，未發現該現象。

綜上所述，高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術可以區分胚胎染色體攜帶或不攜帶親代的異常染色體，從而診斷出染色體正常的胚胎，幫助患者出生染色體正常的嬰兒，對患者及其家庭具有非常重大的意義。本研究從臨床實踐中總結了高通量測序多SNP單體型連鎖分析技術診斷羅氏易位患者正常胚胎治療過程的相關數據，對臨床醫生的決策和患者的知情選擇具有一定的參考價值。