睪酮對棕櫚酸誘導的睪丸支持細胞受損的保護作用

穆楊，羅凌波，楊菁

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，武漢 430060)

睪丸支持細胞為精子細胞提供結構支持，參與構成血睪屏障和生精微環境，并發揮旁分泌作用，在精子的免疫豁免以及成熟中發揮重要作用。肥胖會破壞血睪屏障，損害睪丸支持細胞功能，進而損害男性的生育力[1-5]；睪丸局部游離脂肪酸水平過高，會刺激睪丸支持細胞產生過多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，這些不穩定基團攻擊生物膜結構和細胞DNA，會導致細胞發生凋亡。研究發現，肥胖患者睪酮水平顯著下降[6-7]，使用睪酮替代療法可增加人體的血清睪酮水平[8]，并抑制生精細胞的凋亡[9]；睪酮可抑制睪丸支持細胞的氧化損傷[10]。然而，睪酮對肥胖導致的睪丸支持細胞受損是否具有保護作用，目前仍未見相關研究報道。本研究以棕櫚酸(palmitic acid，PA)體外刺激模擬體內的高脂環境處理小鼠睪丸支持細胞系(TM4)建立體外細胞損傷模型，評價睪酮對支持細胞的保護性作用。

材料與方法

一、主要實驗材料及試劑

TM4小鼠睪丸支持細胞購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)。睪酮購自愛必信(上海)生物科技有限公司(貨號abs816670)；DMEM培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司；CCK8檢測試劑盒購于日本同仁化學；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒均購自南京建成生物技術有限公司；抗Occludin兔單克隆抗體購自英國Abcam。其余所有實驗試劑的純度均為國產分析純。

二、實驗方法

1.TM4細胞培養：將TM4細胞接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2的條件下培養，取處于對數生長期的細胞用于后續實驗。

2.細胞分組處理：將上述TM4細胞分為3組，分別為對照組、PA模型組(PA組)、PA模型睪酮干預組(睪酮+PA組)。PA組僅采用PA干預，PA模型睪酮干預組為PA及睪酮共同干預。PA干預濃度為1 mmol/L[11]，睪酮干預濃度為2 μg/ml[10]。PA和睪酮均采用0.1% DMSO配制。對照組加入等量等濃度的DMSO作為對照。

3.細胞存活率檢測：將TM4細胞種在96孔板上，按照上述實驗分組處理24 h后，使用CCK8試劑盒檢測TM4細胞存活率，實驗操作步驟按照試劑盒說明書進行。以對照組細胞存活率作為100%，計算各組細胞相對存活率。實驗重復6次，每次實驗設置5個復孔。

4.RT-PCR檢測：用0.25%胰蛋白酶消化處于對數生長期的TM4細胞，制成5×104/ml的細胞懸液；將TM4細胞接種在6孔板上，DMEM培養基培養48 h后，去除培養基，PBS清洗3次，將細胞分為3組：對照組、PA組、睪酮+PA組，PA干預濃度為1 mmol/L，睪酮干預濃度為2 μg/ml，處理24 h后加入Trizol(Takara，日本)用于提取細胞總RNA，用反轉錄試劑盒在20 μl RNA反轉錄體系中反轉錄得到cDNA。使用cDNA樣本配制實時定量PCR反應體系，使用實時定量PCR儀檢測Occludin、ZO-1以及核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)、血紅素加氧酶(heme oxygenase-1，HO-1)、CAT和NAD(P)H脫氫酶(NAD(P)H dehydrogenase quinone 1，NQO1)的mRNA表達水平。引物由上海生工合成，引物序列見表1。以GAPDH為內參，利用2-ΔΔCt方法分析mRNA相對表達。

表1 RT-PCR引物

5.Western-blot檢測：取不同處理方案干預24 h的TM4細胞用PBS清洗3次并加入RIPA細胞裂解液，4℃超聲裂解，離心30 min，離心后吸取上清液并采用BCA法測定蛋白濃度。使用SDS-PAGE檢測蛋白表達，在轉膜封閉后使用Occludin單克隆抗體(稀釋比1∶1 000)和GAPDH單克隆抗體(1∶10 000，Abcam，英國)4℃孵育過夜，次日TBS清洗，二抗常溫孵育2 h，TBS清洗后顯色。利用凝膠自動分析成像系統(ECL，Bio-Rad，美國)對蛋白條帶進行采集和灰度值分析，GAPDH作為內參，計算目標蛋白的相對表達量，進行統計分析。

6.SOD和CAT活性及GSH含量的檢測：將TM4細胞按照前述干預培養24 h后，使用胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，4 000 r/min離心5 min，收集細胞超聲裂解后，4℃、1 200g離心5 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定SOD和CAT活性，同時測定GSH含量。

三、統計學方法

采用SPSS22.0進行統計分析。所有數據均以(均數±標準差)表述，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、TM4細胞存活率的改變

PA組TM4細胞存活率較對照組顯著降低[(52.1±3.3)% vs.(100.0±11.9)%，P<0.05]，而睪酮干預之后(睪酮+PA組)細胞存活率較PA組顯著升高[(82.9±6.4)% vs.(52.1±3.3)%，P<0.05](圖1)。

以對照組細胞存活率為100%的各組細胞相對存活率；與對照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖1 不同處理組TM4細胞存活率的改變(n=6)

二、血睪屏障的主要連接分子Occludin和ZO-1的表達改變

與對照組相比，PA處理后TM4細胞中Occludin和ZO-1的mRNA表達水平顯著下降(P<0.05)；與PA組相比，睪酮干預后(睪酮+PA組)Occludin和ZO-1的mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)(圖2)。

A：Occludin；B：ZO-1；與對照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖2 不同處理組TM4細胞中血睪屏障主要連接因子的mRNA表達(n=6)

隨后，我們進一步檢測了Occludin的蛋白表達水平。結果顯示，PA刺激可顯著降低Occludin的蛋白表達水平(P<0.05)；與PA組相比，睪酮處理后(睪酮+PA組)Occludin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(圖3)。

與對照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖3 不同處理組TM4細胞中Occludin 蛋白表達(n=6)

三、SOD和CAT活性以及GSH含量的改變

與對照組相比，PA處理后TM4細胞SOD和CAT活性顯著降低，GSH含量顯著降低(P<0.05)；與PA組相比，睪酮干預之后(睪酮+PA組)SOD和CAT活性顯著升高，GSH含量顯著升高(P<0.05)(圖4)。

A：SOD活性；B：CAT活性；C：GSH含量；與對照組比較，*P<0.05；與PA組比較，#P<0.05圖4 不同處理組TM4細胞中SOD和CAT活性以及GSH含量(n=6)

四、抗氧化基因的改變

與對照組相比，PA處理后TM4細胞內Nrf2、HO-1、CAT和NQO1的mRNA水平下調(P<0.05)；與PA組相比，睪酮干預之后(睪酮+PA組)上述指標的mRNA水平均有所升高(P<0.05)(圖5)。

與對照組比較，*P<0.05；與#PA組比較，P<0.05圖5 不同處理組TM4細胞中抗氧化基因的mRNA表達水平(n=6)

討 論

本實驗采用PA處理TM4細胞模擬肥胖導致的生殖細胞脂毒性，發現PA處理后TM4支持細胞的存活率顯著下降，血睪屏障蛋白Occludin和ZO-1表達下調。以此為體外細胞損傷的模型，發現睪酮干預可增加細胞存活率和屏障蛋白Occludin和ZO-1的表達。此外，睪酮可增加TM4細胞的抗氧化基因的表達，上調抗氧化酶的活性。因此，睪酮對睪丸支持細胞具有保護性作用。

氧化應激在肥胖導致的男性生精功能受損中發揮了重要作用[2，12-14]。我們前期研究也表明，氧化應激致細胞凋亡、自噬激活、內質網應激是肥胖性生精功能受損的重要機制[11，15-16]。氧化應激的過度激活不僅會對精子細胞產生直接損害，還可通過影響睪丸間質細胞和支持細胞的功能，間接地影響精子發生[17-18]。本研究中，PA處理TM4細胞建立細胞損傷模型，抗氧化酶SOD和CAT的活性下調，GSH含量降低，提示TM4遭受氧化損傷，細胞內氧化還原體系被破壞。Nrf2信號通路是最重要的抗氧化轉錄調節因子之一。當細胞遭受刺激時，Nrf2由細胞質轉錄到核內，轉錄合成下游抗氧化因子HO-1和NQO1等發揮抗氧化作用；PA處理后，TM4細胞內Nrf2、HO-1、NQO1表達均下調，提示Nrf2通路的受損可能是肥胖小鼠TM4細胞功能障礙的機制之一。

研究發現，睪酮可以抑制體內的多種促炎癥因子的產生[19-21]，減輕C2C12骨骼肌細胞的凋亡[22]；睪酮治療可有效提高肥胖糖尿病小鼠胰島素的反應性[23]。睪酮可以有效激活衰老肝臟中的Nrf2信號通路，抑制衰老相關的氧化損傷[24]。雖然睪酮可以通過多種途徑發揮保護作用，但是其對肥胖導致的睪丸支持細胞功能受損的具體作用，目前仍未見相關研究報道。本研究發現，PA損傷模型經睪酮干預之后，TM4細胞存活率增加，血睪屏障的主要連接分子Occludin和ZO-1表達上調。同時，抗氧化酶活性增加，Nrf2等基因表達上調。這提示，睪酮保護支持細胞免于PA損傷可能是通過增強其抗氧化的作用。

本研究尚有不足：僅針對睪丸支持細胞組成血睪屏障的功能進行了研究，對抑制素B和雄激素受體的表達未進行檢測，睪酮在此方面的作用仍需進一步實驗研究加以證實。本研究結論目前僅建立在細胞模型的體外實驗基礎之上，尚需要進一步的動物在體實驗進行驗證，從而為可能的臨床應用提供依據。

綜上所述，實驗條件下外源性睪酮可提高體外培養支持細胞的抗氧化酶活性，改善PA誘導的細胞功能損傷，起到細胞保護的作用。我們的研究為肥胖性男性不育的治療提供了新的思路。