雄鼠生殖細胞中FHAD1表達與功能的初步研究

張茜，劉辰辰，張舒雅

(1.南京醫科大學附屬淮安第一醫院，淮安市第一人民醫院，淮安 223300；2.南京醫科大學生殖醫學國家重點實驗室 組織胚胎學系，南京 210000；3.南京醫科大學康達學院基礎醫學部，連云港 222000)

叉頭相關的磷蛋白結合結構域(forkhead-associated phosphopeptide-binding domain，FHAD)普遍存在于原核生物和真核生物的多種蛋白質中[1-5]。在真核生物中DNA損傷檢控點介導因子1(mediator of DNA damage checkpoint-1，MDC1)定位于DNA斷裂位點，通過其FHAD區域募集到活化的細胞周期檢查點激酶2(cell cycle checkpoint kinase 2，CHK2)，并且在CHK2介導的DNA損傷應答中起關鍵作用[6]。在酵母和人類的細胞核中發現了許多含有FHAD的蛋白質，它們參與DNA損傷修復，細胞周期檢測點調控、mRNA預處理等[3]。例如，發芽酵母的釀酒酵母檢查點激酶RAD53(serine/threonine/tyrosine protein kinase RAD53，RAD53)中的FHAD2突變可阻止與磷酸化的細胞周期檢測點蛋白Rad9(checkpoint clamp complex protein Rad9)結合，從而消除了DNA損傷引起的細胞周期停滯[7]。在人類中，酵母磷脂酸胞苷轉移酶(CDP-diacylglycerol synthase 1，CDS1)的同源物CHK2/hCDS1包含FHAD，其參與了對DNA損傷的細胞周期檢查點反應[7-11]。研究表明有FHAD的蛋白參與調控G2/M DNA損傷檢查點，可防止帶有DNA 損傷的細胞進入有絲分裂(M期)[7]。但當DNA損傷不能及時或準確地修復，就會導致基因突變、引起細胞死亡或腫瘤的發生。

已知叉頭相關的磷蛋白結合結構域1(FHAD1)位于小鼠4號染色體，編碼由236個氨基酸組成的蛋白。目前為止，對于FHAD蛋白家族中的FHAD1在小鼠雄性生殖功能領域的研究幾乎為零。基于FHAD的相關功能性，本研究主要采用RT-PCR技術和Western Blot技術分別在基因和蛋白水平上對其在雄性小鼠生殖細胞的表達進行研究。磷酸化組蛋白H2AX(γH2AX)是檢測細胞DNA雙鏈斷裂的敏感而有效的指標[12]，磷酸化奈梅亨破損癥候群1(Phosphorylated Nijmegen breakage syndrome 1，p-NBS1)是DNA損傷修復關鍵蛋白，并和其他蛋白組成基因修復復合體，其在DNA雙鏈修復方面發揮重要作用[13]。利用RNA干擾技術，siRNA轉染GC-2細胞干擾FHAD1表達，檢測γH2AX、p-NBS1水平，初步探討FHAD1在生精細胞DNA損傷修復中的作用機制。

材料和方法

一、實驗材料

1.動物：0.5 d齡C57BL/6J雄性小鼠(0周齡)5只，體重約1.5 g；1周齡(5.5 d)雄鼠3只，體重約3 g；2周齡(14 d)雄鼠3只，體重約7 g；3周齡(21 d)雄鼠3只，體重約15 g；4周齡(28 d)雄鼠3只，體重約22 g；5周齡雄鼠(35 d)3只，體重約28克。成年雌、雄鼠(42 d)各3只，體重約32 g。均購于南京醫科大學實驗動物基地生產部，實驗動物生產許可證號SCXK(蘇)2021-0001。

2.細胞：小鼠精母細胞系GC-2來自美國ATCC細胞庫。

3.主要試劑和儀器：蛋白酶抑制劑Cocktail(Merck，美國)；DNA標志物DL1000(TaKaRa，日本)；RNA抽提試劑盒(Qiagen，德國)；反轉錄試劑盒 PrimeScriptRT Master Mix(TaKaRa，日本)；牛血清白蛋白BSA(上海化學試劑有限公司)；胎牛血清(Gibco，美國)；DMEM(Invitrogen，美國)；羊抗單克隆FHAD1抗體(Santa Cruz Biotech，美國)；兔抗多克隆GAPDH、NBS1、pNBS1抗體(Abcam，英國)；兔抗多克隆γH2AX抗體(Cell Signaling Technology，美國)；山羊抗兔IgG、驢抗羊IgG(Thermo scientific，美國)；ECL試劑盒(Perkin Elmer，美國)；細胞轉染試劑LipofectamineTM2000、Opti-MEM 無血清培養基(Invitrogen，美國)。

二、實驗方法

1.動物取材、處理：頸椎脫臼法處死小鼠。取成年小鼠的心、肝臟、脾、肺、腎臟、腦、肌肉、腸、脂肪、卵巢和睪丸，取各周齡小鼠的睪丸組織，分別放入蛋白裂解液和Trizol中分別用于下一步的蛋白提取和RNA的提取。

2.細胞培養及RNA干擾實驗：GC-2細胞用DMEM培養基加10%胎牛血清培養，培養在37℃、5%CO2的細胞培養箱中。細胞以2×105/孔的密度接種于6孔板。當細胞生長密度達到50%～60%時，轉染siFHAD1(FHAD1敲低組)與siNC(南京吉瑪，陰性對照組)；siRNA：脂質體Lipofectamine 2000=1∶0.1(pmol∶μl)，48 h后收集細胞。其中siFHAD1序列：正義鏈UUAAGACGUUUUCUUUCUGCU，反義鏈CAGAAAGAAAACGUCUUAAAU。

3.不同階段生精細胞分離：利用密度梯度沉降法分離生精細胞，精原干細胞從0周小鼠睪丸獲得，粗線期精母細胞從3周小鼠睪丸獲得，圓形精子細胞從5周小鼠睪丸獲得。頸椎脫臼法處死小鼠，取出睪丸并去白膜，用小剪刀將曲細精管剪碎至漿糊狀，轉移到50 ml離心管中，用克-亨氏液(武漢普諾賽)補至20～25 ml，冰上靜置5 min，棄去上清。加入10 ml(1 mg/ml)膠原酶及10 μl(1 mg/ml)的脫氧核糖核酸酶I，37 ℃水浴振蕩約10 min并不時用吸管吹吸，至生精小管消化成極小片段，鏡檢大部分生精細胞從生精上皮分離出來，后加入約30 ml預冷的克-亨氏液，終止消化。4℃、1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入5 ml(濃度1 mg/ml)胰蛋白酶及10 μl(1 mg/ml)的脫氧核糖核酸酶I，37 ℃水浴振蕩約10 min，并不時用吸管吹吸，至鏡檢視野里絕大部分是散在的單細胞，加入約30 ml預冷的0.5% BSA/克-亨氏液，終止消化。4℃，1 200 r/min，離心5 min，棄上清。細胞沉淀用0.5% BSA/克-亨氏液洗1次，4℃、1 200 r/min離心5 min，棄上清。最后細胞沉淀用15～20 ml 0.5% BSA/克-亨氏液懸浮并經40 μm細胞網篩過濾。重力密度梯度形成及上樣等步驟參考文獻報道[14]。

4.RT-PCR：Trizol法提取小鼠的各組織臟器以及各周齡小鼠睪丸RNA。用 RNA抽提試劑盒提取支持細胞、間質細胞、精原干細胞、粗線期精母細胞和圓形精子的RNA。然后反轉錄為cDNA，而后進行RT-PCR。引物序列見表1。PCR擴增條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，fhad1 57℃、β-actin57.5℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min。重復35個循環，4℃保存。

表1 擴增基因片段的引物序列

5.Western Blot：選用北京碧云天的RIPA蛋白裂解液以及細胞裂解液分別勻漿裂解成年小鼠各組織臟器和GC-2細胞，BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣量為25 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉印至PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后棄去封閉液，TBS-T溶液洗3次，每次10 min；FHAD1抗體、NBS1抗體、pNBS1抗體、γH2AX抗體均按照1∶500比例稀釋，GAPDH抗體按照1∶2 000比例稀釋，4℃過夜；TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入1∶5 000稀釋的二抗，室溫下孵育2 h；TBS-T洗膜后加入ECL化學發光液顯影。

三、統計學處理

結 果

一、fhad1基因在成年小鼠不同組織臟器表達水平

RT-PCR結果顯示Fhad1 mRNA在小鼠的肺中略有表達，在睪丸中高表達，其他臟器中不表達(圖1)。

圖1 成年小鼠不同組織臟器fhad1 mRNA表達情況

二、FHAD1在成年小鼠不同組織臟器的蛋白表達情況

Western Blot檢測結果顯示，FHAD1蛋白情況與mRNA表達一致，在小鼠睪丸中高度表達，在肺中也有所表達(圖2)。

圖2 成年小鼠不同組織臟器FHAD1蛋白表達情況

三、fhad1基因在不同周齡小鼠睪丸的表達

RT-PCR結果顯示fhad1 mRNA在2周小鼠睪丸開始表達，至3周開始表達量明顯升高并持續表達至成年小鼠睪丸(圖3)。

圖3 不同周齡小鼠睪丸中的fhad1 mRNA表達情況

四、FHAD1蛋白在不同周齡小鼠睪丸中的表達情況

Western Blot檢測FHAD1在不同周齡小鼠睪丸中的表達，結果顯示FHAD1在2周小鼠睪丸開始表達，至3周開始表達量明顯升高并持續表達至成年小鼠睪丸(圖4)，與RT-PCR結果一致。

圖4 不同周齡小鼠睪丸中FHAD1蛋白表達情況

五、fhad1基因在小鼠不同階段生精細胞中的表達

為了進一步探究fhad1基因在小鼠睪丸中的具體表達定位，我們采用STA-PUT分選出不同階段的生精細胞后，RT-PCR檢測在小鼠不同階段生精細胞中fhad1基因表達情況。結果顯示fhad1 mRNA主要在粗線期精母細胞和圓形精子細胞中表達(圖5)。

圖5 小鼠不同階段生精細胞中fhad1 mRNA表達情況

六、干擾FHAD1對DNA損傷修復相關蛋白的影響

為了研究FHAD1是否參與了DNA損傷修復，我們在GC-2細胞中瞬時轉染外源性siFHAD1后繼續培養48 h去敲低FHAD1的表達。Western Blot實驗結果顯示，轉染siFHAD1后，FHAD1被成功敲低，表明siFHAD1轉染效率較好；與陰性轉染對照組相比，敲低FHAD1后DNA損傷分子標記物γH2AX水平顯著上升[(1.99±0.14)vs.(0.99±0.10)]、DNA損傷修復關鍵蛋白p-NBS1水平顯著下降[(0.24±0.07)vs.(1.01±0.10)](P<0.001)(圖6)。

與陰性轉染對照組比較，*P<0.001圖6 FHAD1敲低后GC-2細胞γH2AX、NBS1、p-NBS1蛋白的表達變化

討 論

DNA損傷會破壞機體細胞、組織及器官。DNA損傷的類型包括：點突變、缺失、插入、倒位或轉位和雙鏈斷裂。為了確保細胞周期有序進展，有許多被稱為細胞周期檢查點蛋白的質量控制點。這些檢測點蛋白能及時修復問題以保證細胞周期安全有序進行。目前，依據細胞周期的順序循環分為：G1-S期檢查點，S期檢查點，G2期檢查點和M期檢查點。細胞周期調控需要大量的胞內外信號的配合，如果缺乏適當的信號，細胞將不能從一個階段進入下一個階段，這種現象稱為細胞周期阻滯。當細胞周期正常時，如果DNA出現損傷，細胞周期停在相應檢查點，細胞周期阻滯為細胞提供額外的時間用于修復損傷，從而減少突變的發生，避免腫瘤的產生。其中G2/M期阻滯，可以防止帶有DNA損傷的細胞進入有絲分裂期，如果檢查點失活，使損傷DNA進入有絲分裂期，引起基因的不穩定性，最終導致癌突變的積聚。因此細胞進化出了一種DNA損傷應激反應來修復DNA損傷，高度保守的DNA損傷修復應答機制可以維持基因組的完整性[15]。眾所周知，與體細胞相比，生殖細胞對于DNA損傷更加敏感。在精子發生過程中，生物體自有DNA損傷修復機制能及時修復來源于外界環境或生物體自身產生的損傷[16]。目前已知的DNA損傷修復方式至少有5種，包括堿基切除修復、核苷酸切除修復、錯配修復、雙鏈斷裂修復、直接修復等[17]，其中DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand breaks，DSB)修復是非常重要的一種。已有研究表明包含FHAD的蛋白在細胞周期檢驗點調控和DNA損傷修復過程中起重要作用[18]。

精子發生是一個復雜的雄性生殖細胞分裂和分化的過程，其中包括精原細胞的有絲分裂，精母細胞的減數分裂和精子細胞的變形最終形成精子[19-21]。在小鼠精子發生過程中，2周左右開始出現粗線期精母細胞[22]。初級精母細胞的減數分裂，其前期時間很長，變化過程也很復雜，包括細線期、合線期、粗線期、雙線期及終變期。粗線期時同源染色體聯會完全，同源染色體之間非姐妹染色單體交換，此過程發生主要的遺傳物質重組事件，細胞啟動程序性的DSB并通過同源重組途徑進行修復，以促進同源染色體的交換和分離。如果精母細胞在程序性DSB修復起始過程中染色體結構不能正常疏松，進而DNA損傷修復因子不能正確及時地招募到斷裂位點，從而嚴重影響了程序性DSB的修復、同源染色體的聯會及交叉互換等過程，最終造成雄性不育[23]。本研究中，RT-PCR和Western Blot實驗均顯示FHAD1在2周齡小鼠睪丸開始有所表達，并且隨著周齡增加，表達量隨之增多；而不同階段生精細胞的RT-PCR結果顯示fhad1 mRNA主要表達在粗線期精母細胞和圓形精子。以上結果提示我們FHAD1在雄性小鼠中可能參與了生精細胞的早期發育，并且可能參與了生精細胞的DNA損傷修復。

在DSB發生的同時，位于絲氨酸139位C-端保守區域內的H2AX磷酸化形成γH2AX。因此γH2AX的形成是DSB的一個標志[12]。本研究結果顯示，干擾FHAD1表達后，DNA損傷分子標記物γH2AX蛋白表達增高，提示DNA損傷變多。NBS1在人類中也稱為Nibrin，通常認為它是一種支架蛋白，用于指導DSB位點上的其他DNA損傷反應因子并與之結合。NBS1與DNA損傷位點附近的磷酸化組蛋白變體H2AX(γH2AX)相互作用，將MRE11/RAD50復合體轉運到核中，復合體檢測到斷裂并激活共濟失調毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia mutated Protein，ATM)。NBS1被ATM磷酸化，并激活下游蛋白質，如人體抑癌基因p53、乳腺癌1號基因(breast cancer susceptibility1，BRCA1)和CHK2來協助修復和控制細胞周期進程。因此NBS1作為激活DNA損傷修復信號傳導的關鍵因子，在維持基因組的穩定和DNA損傷修復過程中起著重要的作用[24]。本研究發現干擾FHAD1表達能顯著抑制DNA修復關鍵蛋白NBS1的磷酸化表達，因此，我們認為，FHAD1可能通過促進NBS1蛋白的磷酸化，進而促進精母細胞DNA的損傷修復能力。但是FHAD1參與DNA損傷修復的具體機制仍需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究初步探討了FHAD1在雄性小鼠睪丸中的表達及功能，FHAD1為雄性小鼠睪丸特異蛋白，主要表達在粗線期的精母細胞以及圓形精子細胞中。下調FHAD1基因的表達使GC-2細胞的DNA損傷增加，機制可能與NBS1蛋白的磷酸化有關，為FHAD1在生殖細胞中的功能探討提供了實驗基礎。