主動脈夾層患者血清中miR-20、miR-15a水平與預后關系

李 亮，祁國榮，路 霖，王黎明，龐云峰，徐效龍，李小玲

(青海省心腦血管病?？漆t(yī)院 1.心臟外科;2.ICU，青海 西寧810000)

主動脈夾層是血管外科常見的危重急癥，具有病情危急，死亡率高的特點，嚴重威脅人類生命安全[1]。微小RNA(miRNA)是具有調(diào)控作用且能穩(wěn)定存在于血液中的小分子RNA，當疾病發(fā)生時，miRNA存在異常表達，有望成為多種疾病診治、預后評估指標[2]?；颊甙l(fā)生主動脈夾層后，血清miRNA存在異常表達[3]。熊等[4]研究顯示主動脈微小RNA-20(microRNA-20，miR-20)在動脈粥樣硬化中表達下調(diào)，經(jīng)麝香通心滴丸治療后，其表達水平明顯升高，miR-20可能與動脈粥樣硬化密切相關。微小RNA-15a(miR-15a)在急性主動脈夾層患者血漿中高表達，在診斷急性主動脈夾層方面具有良好的臨床價值[5]。本研究通過檢測miR-20、miR-15a在主動脈夾層患者血清中的表達情況，為疾病臨床判斷、預后評估提供可靠參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取自2015年4月至2018年7月本院確診為主動脈夾層患者109例為患病組，其中男62例，女47例；年齡56-76歲，平均年齡(65.97±10.16)歲；體質(zhì)指數(shù)(BMI)18.97-26.78 kg/m2，平均BMI(23.62±3.05)kg/m2。并選擇同期106例健康體檢者為健康組，其中男55例，女51例；年齡55-75歲，平均年齡(65.56±9.98)歲；BMI 18.26-27.15 kg/m2，平均BMI(23.89±3.10) kg/m2。兩組性別、年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標準：(1)所有患者均符合主動脈夾層的診斷標準[6]；(2)所有患者經(jīng)MR或CT確診為主動脈夾層；(3)生理、病理診療資料齊全者。排除標準：(1)合并肺栓塞、心肌梗死、下肢靜脈血栓病史者；(2)失訪者；(3)近期合并急慢性感染、急性外傷、手術者；(4)合并惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病者；(5)存在嚴重電解質(zhì)紊亂或肝腎功能不全者；(6)患有馬凡綜合征者。

所有患者家屬簽署知情同意書，且該項研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準后實施，符合《赫爾辛基宣言》。

預后情況：對所有患者進行為期6個月的電話隨訪，以患者死亡為預后不良事件。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑購買于美國GIBCO BRL代理創(chuàng)亞化工(上海)有限公司，Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)Promega A3500購買于上海根生生物科技有限公司，Realtime PCR Master (SYBR Green)核酸擴增(PCR)試劑盒購買于北京百奧萊博科技有限公司；人超敏C反應蛋白(hs-CRP)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) Kit購買于武漢華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1樣本采集及預處理 住院第二日清晨患者空腹狀態(tài)下、健康體檢者體檢當日，以真空采血管收集患者約4 mL外周靜脈血,自然凝集約35 min，于室溫以4100 r/min離心13 min，分裝后保存于-70℃冰箱中，待測。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測兩組血清中miR-20、miR-15a表達水平 取出-70℃冰箱中凍存的血清樣本，置于冰盒內(nèi)，冰上融化，依據(jù)TRIzol試劑盒說明書加適量TRIzol裂解液，參照其說明書操作步驟從血清樣本中提取總RNA。檢測所提取RNA樣本在260 nm、280 nm波長處的吸光度(Absorbance，A)，以A260/A280比值在1.8-2.0范圍內(nèi)表示RNA樣本純度較好。以所提純度較好的RNA樣本為模板，按照Reverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)Promega A3500說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù) Realtime PCR Master (SYBR Green)核酸擴增(PCR)試劑盒說明書配備目標PCR反應體系，將目標cDNA進行擴增、檢測。miR-20、miR-15a均以U6為內(nèi)參。以2-ΔΔCT法計算miR-20、miR-15a相對表達水平。各引物序列見表1。

表1 miR-20、miR-15a及內(nèi)參U6的引物序列

1.3.3一般資料檢查 (1)利用血壓儀檢測患者血壓，以收縮壓≥140 mHg，舒張壓≥90 mHg為高血壓。(2)ELISA法檢測超敏C反應蛋白水平。檢測所有受試者血清中超敏C反應蛋白的含量，參照試劑盒說明書操作流程對其含量進行檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-20、miR-15a表達比較

與健康組相比，患病組血清miR-20表達水平明顯降低(P<0.05)，miR-15a水平及超敏C反應蛋白均明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血清miR-20、miR-15a表達水平比較

2.2 主動脈夾層患者不同預后臨床資料比較

與預后良好組相比，預后不良組合并高血壓比例、超敏C反應蛋白水平明顯升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 主動脈夾層患者預后不同臨床資料比較例)

2.3 主動脈夾層患者不同預后血清miR-20、miR-15a表達比較

與預后良好組相比，預后良不良組主動脈夾層患者血清中miR-20水平明顯降低(P<0.05)，miR-15a水平明顯升高(P<0.05)。詳見表4。

表4 主動脈夾層患者不同預后血清miR-20、miR-15a表達比較

2.4 Logistic回歸分析主動脈夾層預后的影響因素

以主動脈夾層預后為因變量，以高血壓、超敏C反應蛋白、miR-20、miR-15a為自變量，行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示高血壓、超敏C反應蛋白、miR-15a為主動脈夾層預后的危險因素(P<0.05)，miR-20為主動脈夾層預后保護因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 影響主動脈夾層預后的Logistic回歸分析

2.5 ROC評價血清miR-20、miR-15a對主動脈夾層不良預后的診斷價值

ROC曲線顯示，血清miR-20表達水平預測主動脈夾層不良預后的曲線下面積(AUC)為0.825，其靈敏度、特異度分別為73.9%、82.5%；血清miR-15a表達水平預測主動脈夾層不良預后的AUC為0.857，其靈敏度、特異度分別為76.1%、81.0%；血清miR-20、miR-15a聯(lián)合預測主動脈夾層不良預后的AUC為0.924，其靈敏度、特異度分別為93.5%、76.2%。詳見表6、圖1。

表6 各項指標對主動脈夾層不良預后的診斷價值

圖1 血清miR-20、miR-15a對主動脈夾層不良預后的診斷價值

3 討論

主動脈夾層是由動脈硬化、高血壓、先天性心血管病等引發(fā)的一種心血管系統(tǒng)疾病，病情危重，易造成患者死亡[7]。因此，尋找對主動脈夾層具有較高診斷價值的指標，對提高主動脈夾層患者生存率具有重要意義。

miRNA是一類廣泛分布于機體各細胞、組織、血液中的單鏈RNA分子，在炎癥反應、信號轉(zhuǎn)導、組織分化等過程中均發(fā)揮一定作用[8]。miR-320在主動脈夾層患者單核細胞/巨噬細胞中表達下降，可通過巨噬細胞調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，進而影響主動脈夾層的發(fā)病過程[9]。miR-146b在急性Stanford A型主動脈夾層患者外周血和主動脈壁組織中表達上調(diào)，其可能有助于急性Stanford A型主動脈夾層的發(fā)生與發(fā)展[10]。miR-4787-5p、miR-4306在急性主動脈夾層患者血漿中呈過表達，其下游靶標多囊蛋白-1和轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達下降，兩者可作為急性主動脈夾層診斷的潛在生物標志物[11]。以上研究表明，miRNA表達異常與主動脈夾層發(fā)病進展密切相關。miR-20可調(diào)節(jié)心肌缺血，有望作為心肌缺血性疾病的診療靶標[12]。miR-20a在冠狀動脈疾病中表達異常，可能具有作為冠狀動脈疾病治療靶標的巨大潛力[13]。以上研究表明，miR-20可能與心血管疾病進展有關。本研究顯示，患病組血清miR-20表達水平明顯低于健康組，提示miR-20在主動脈夾層發(fā)病進程中發(fā)揮一定作用。miR-15a-5p在栓塞性中風中表達異常，其可影響心房顫動、心肌梗死、二尖瓣狹窄及主動脈夾層，進而影響栓塞性中風的發(fā)生、發(fā)展，可作為栓塞性中風診斷的潛在生物標志物[14]。miR-15a-3p在腹主動脈瘤中表達失調(diào)，其可作為腹主動脈瘤診斷的標志物[15]。以上研究表明miR-15a成員可影響主動脈夾層發(fā)展過程，推測miR-15a可能在主動脈夾層發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究中miR-15a水平明顯高于健康組，與Dong等[5]研究結(jié)果類似，提示miR-15a可能參與主動脈夾層發(fā)生發(fā)展進程。主動脈夾層患者經(jīng)正規(guī)治療后，檢測患者血清miR-20、miR-15a表達水平，結(jié)果顯示，預后不良組主動脈夾層患者血清中miR-20水平明顯低于預后良好組，miR-15a水平明顯高于預后良好組，提示血清miR-20、miR-15a水平有助于預后情況判定。

高血壓是主動脈夾層的常見病因，超敏C反應蛋白與急性主動脈夾層關系密切，可作為急性主動脈夾層有效篩選指標[16]。本研究中患病組血清超敏C反應蛋白明顯高于健康組，提示超敏C反應蛋白可能在主動脈夾層發(fā)展進程中發(fā)揮一定作用。進一步研究顯示預后不良組中高血壓患者比例、超敏C反應蛋白水平明顯高于預后良好組，提示高血壓、超敏C反應蛋白水平對主動脈夾層預后情況具有一定的評估價值。本研究超敏C反應蛋白分析發(fā)現(xiàn)高血壓、超敏C反應蛋白、miR-15a為影響主動脈夾層預后的危險因素，miR-20為影響主動脈夾層預后保護因素，提示高血壓，超敏C反應蛋白及miR-15a水平過高，miR-20水平過低，均可能增加主動脈夾層患病幾率，早期聯(lián)合監(jiān)測血清miR-20、miR-15a及超敏C反應蛋白水平，有利于主動脈夾層患者及時診治。研究發(fā)現(xiàn)血清中miR-20、miR-15a水平診斷主動脈夾層不良預后的AUC分別為0.825、0.857，當血清miR-20相對表達量低于0.71或血清miR-15a水平高于1.69時，血清miR-20、miR-15a水平診斷主動脈夾層不良預后的準確度較高，提示miR-20、miR-15a對診斷主動脈夾層具有一定參考價值；血清miR-20、miR-15a聯(lián)合診斷主動脈夾層不良預后的AUC為0.924，其靈敏度為93.5%，特異度為76.2%，約登指數(shù)為0.697，提示miR-20、miR-15a聯(lián)合可大幅度提高診斷主動脈夾層不良預后的靈敏度，增加主動脈夾層不良預后的診斷價值。

綜上所述，主動脈夾層患者血清中miR-20表達下調(diào)，miR-15a表達上調(diào)，兩者聯(lián)合對提高主動脈夾層診斷效能具有一定臨床價值。但本研究實驗取樣量較少，可能導致結(jié)果存在一定程度偏差，后期實驗將加大實驗樣本量進行更深入的研究。