NE-IFISH法在胰腺癌循環腫瘤細胞檢測中的價值

王 欣,曹軍麗,佟明銘

(1.秦皇島市中醫醫院 重癥醫學科,河北 秦皇島066000；2.秦皇島市第一醫院 腫瘤科)

循環腫瘤細胞(CTCs)對疾病診斷和預后評估有重要意義，被認為是一種非侵入性的活檢替代指標[1]。然而，外周血中的CTCs含量較少，檢測難度高，檢測前細胞富集是極為關鍵的一步。本研究通過對比Cell Search法和陰性富集聯合免疫熒光染色體原位雜交(NE-IFISH)技術對胰腺癌CTCs的檢測價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

秦皇島市第一醫院自2018年6月至2019年6月收治的41例胰腺癌患者，包括男性25例，女性16例，年齡41-80歲，平均(62.3±8.6)歲。所有患者均經影像學檢查和穿刺活檢診斷為胰腺癌的初診病例，且未合并其他位置腫瘤。選擇同期體檢的40例健康志愿者為對照組，男性23例，女性17例，年齡42-78歲，平均(63.1±7.5)歲。兩組一般資料比較無統計學差異(P>0.05)。

1.2 CTCs富集方法

使用專用的CTCs采血管采集空腹肘靜脈血7.5 ml，室溫下離心，離心力800 g，離心時間8 min，棄去上清，下方沉淀轉移至離心管。采用移液器取3 ml CTCs分離液，加入離心管的底部，室溫離心，離心力450 g，離心時間8 min。離心后有3層液體，棄掉底層的棕紅色細胞，將上面兩層轉移至新的離心管，加入免疫磁珠，每管300 μl，室溫搖床20 min。磁力架上混勻后，將液體再次轉移至一個新的離心管，并加入CTCs富集緩沖液，顛倒混勻后，室溫離心，離心力550 g，離心時間4 min，棄掉上清，再次加入CTCs富集緩沖液，重復離心一次。得到的CTCs富集樣本分為兩份，一份用于Cell Search檢測，另一份用于NE-IFISH檢測。

1.3 CTCs檢測方法

Cell Search檢測：利用美國Biolegend公司提供的Cell Search系統測定標本CTCs計數，CTCs判斷標準為EpCAM+、CK+、CD45-、DAPI+。NE-IFISH檢測：(1)棄上清，加2 μl染色液，震蕩搖勻后靜置20 min，加入抗體(組成為1 μl anti- CD45+1 μl anti- CEP-8+1 μl anti- CK18+1 μl Anti-h WBC+200 μl抗體溶劑)，避光孵育30 min。加入CTCs緩沖液，混勻后再次離心，550 g×4 min，棄上清，沉淀中加 CTCs固定液并涂片用于后續檢測。(2)根據說明書要求配置FR1/FR2混合液，滴加于載玻片，避光孵育10 min，吸除多余液體，以FR3液清洗4次。無水乙醇脫水后，避光條件下滴加10 μl探針，封片后置入雜交儀，76℃變性10 min；37℃雜交4 h，去除封片膠，溫浴脫除蓋玻片。采用抗體洗滌液洗滌4次。滴加5 μl DAPI染色液標記細胞核，封片，顯微鏡下觀察CTCs。

1.4 統計學方法

采用 SPSS 22.0分析數據，本研究中CTCs數目不符合正態分布，以中位數(最小值-最大值)表示，行Mann-Whitney檢驗；CTCs陽性率采用百分比表示，組間比較行χ2檢驗；采用受試者工作曲線(ROC)分析CTCs的診斷價值；采用K-M法進行生存分析；P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究組與對照組患者的CTCs檢測結果

在41例研究組患者中，NE-IFISH法共檢測到132個CTCs(33例患者陽性)，Cell Search法共檢測到111個CTCs(29例患者陽性)，NE-IFISH法檢測到的陽性率和CTCs總數略高于Cell Search法，但組間差異無統計學意義(P>0.05)。但無論是NE-IFISH法還是Cell Search法，研究組的CTCs陽性率和CTCs數目均明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 研究組與對照組患者的CTCs檢測結果匯總

2.2 兩種方法對胰腺癌的臨床診斷與病情評估價值

如表2所示，NE-IFISH法與Cell Search法對胰腺癌發生，胰腺癌淋巴結轉移、遠處轉移及分期Ⅲ-Ⅳ期均有較好的評估價值(AUC=0.658-0.890，P<0.05)，在診斷胰腺癌發生和評估分期Ⅲ-Ⅳ期方面，NE-IFISH法的應用價值優于Cell Search法，組間差異有統計學意義(P<0.05)。各個項目的ROC曲線詳見圖1。

表2 兩種檢測方法的臨床診斷與預后評估價值

圖1 兩種檢測方法診斷胰腺癌及其病理特征的ROC曲線

2.3 研究組患者手術前后的CTCs檢測結果

手術后，NE-IFISH法檢測到的陽性率和CTCs總數也略高于Cell Search法，但組間差異無統計學意義(P>0.05)；無論是NE-IFISH法還是Cell Search法，手術后的CTCs陽性率和CTCs數目均明顯低于手術前，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 研究組患者手術前后CTCs檢測結果

2.4 兩種方法對胰腺癌的預后評估價值

本次研究共隨訪9-24個月，中位隨訪時間19個月，截止到末次隨訪，復發或轉移27例，死亡11例，均死于復發或轉移。根據術后CTCs檢測情況，將患者分為CTCs陽性及CTCs陰性兩組，繪制生存曲線，結果顯示NE-IFISH法CTCs陽性和陰性患者的中位生存期分別為23個月和20個月，中位無進展生存期分別為22個月和15個月；Cell Search法CTCs陽性和陰性患者的中位生存期分別為22個月和17個月，CTCs陽性患者生存期均低于CTCs陰性患者(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 CTCs與胰腺癌術后生存的關系考察

3 討論

Cell Search系統是唯一被美國食品及藥物管理局(FDA)批準用于臨床檢測外周血CTCs的檢測平臺，但對胰腺癌CTCs的檢測精度不佳，主要是因為胰腺癌為上皮間質轉化比較活躍的腫瘤，在這一病理行為中上皮細胞特異性抗原EpCAM表達會減弱[2]。NE-IFISH檢查通過CD45、CEP-8、CK18、DAPI 染色及雜交特異性來鑒別CTCs。CEP-8這一指標主要反映8號染色體的異常，既往有研究對16種胰腺癌細胞系的分析結果顯示幾乎所有細胞的8號染色體均存在異倍性，故而CEP-8可以作為胰腺癌細胞的重要特征，在鑒別胰腺癌CTCs方面具有較高的優勢[3-4]。

曹旻璐等[5]采用Cell Search系統檢測了7種腫瘤患者的CTCs情況，胰腺癌的術前和術后檢出率分別為62.0%和25.0%。本研究采用Cell Search系統檢測胰腺癌的術前和術后的CTCs檢出率分別為70.7%和37.2%，而NE-IFISH法的陽性率分別為80.5%和58.5%。另外，CTCs可以衡量腫瘤負擔，輔助病情診斷與預后評估的觀點已被較多學者所證實[5-7]，本研究還發現在診斷胰腺癌發生和評估分期Ⅲ-Ⅳ期方面，NE-IFISH法的應用價值優于Cell Search法。在隨訪中發現CTCs陽性患者的生存期和無進展生存期均低于CTCs陰性患者。