下一代測序鑒定新等位基因HLA-DQB1*04:74和HLA-DRB1* 07:01:23序列及家系調查

武君華，王滿妮，王天菊，王小芳，尚利俠，陳 樂，房 婕，齊 珺

(西安市中心血站,陜西 西安710061)

人類對主要組織相容性復合物(MHC)的研究起源于同種異體組織器官移植和移植物的急性排斥反應。人類的MHC稱為白細胞抗原(HLA)系統。HLA主要的遺傳特征是共顯性、多基因性和極度豐富的多態性。1958年第一個HLA抗原被檢出，經過數十年的發展，相關工作者一直努力應對 HLA不斷擴大的等位基因數量。截至2020年4月更新的國際免疫遺傳IMGT/HLA數據庫3.40.0版(http//:www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)顯示，共計發現HLA-A座位等位基因6082種，B座位等位基因7255種，C座位等位基因5842種，DRB1座位等位基因2706種，DQB1座位等位基因1826種。本中心在2018-2019年對移植醫院造血干細胞供受者進行HLA移植配型實驗中，發現2例供受者攜帶疑似新等位基因。經確證實驗驗證后將序列上傳至世界基因庫(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank Bankit)比對核準，在向世界衛生組織(WHO)提交一系列信息后，均被確認為新等位基因，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2018-2019年來西安市中心血站高分確認實驗室進行造血干細胞移植(HSC)前HLA高分辨分型檢測過程中，分別發現 2例供受者攜帶疑似新等位基因。第1例先證者為患者，56歲，女性，臨床診斷為骨髓纖維化；第2例先證者為另一名患者的同胞哥哥，63歲，男性。在進行HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位點基因分型時，發現第1例先證者的HLA-DRB1位點、第2例先證者的HLA-DQB1位點分型結果異常，遂行進一步確認。

1.2 主要儀器

核酸自動提取儀(臺灣Magcore HF16)；GeneQuant pro核酸檢測儀(美國GE公司 Biochrom)；PCR擴增儀(德國SENSO公司 Sensoquest LabcycLer；美國MJ Research 公司 PCR-225;美國ABI公司 ABI9700)；流式微磁珠分析儀(美國Luminex公司 Luminex 200)；全自動基因測序分析儀(美國ABI公司 ABI-3730xl)；ION S5TM測序儀(美國One Lambda公司)

1.3 主要試劑

1.4 方法

1.4.1標本采集和基因組DNA提取 采集2例先證者外周靜脈抗凝血5 ml×2管。在發現2例先證者結果異常后，分別對先證者血樣重新采集抽提DNA并進行確認：一管血樣采用手工DNA提取試劑盒，按照試劑操作說明提取基因組DNA；另一管血樣用核酸自動提取儀，嚴格按照儀器操作說明提取基因組DNA。

1.4.2聚合酶鏈式反應-序列特異性寡核苷酸探針(PCR-SSO)方法檢測 PCR-SSO采用LABTypeTMRSSOH 1A/1B/1C/2B1/2Q試劑盒，嚴格按照說明書對2例樣本的HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位點進行基因分型。即經PCR擴增，擴增產物與包被在微珠上的有熒光的特異性探針雜交結合后，通過Luminex IS-200流式微磁珠分析儀進行讀板，應用 Fusion4.1軟件進行判讀。

1.4.4高通量測序(NGS)(ION S5TM測序平臺) 采用NXTypeTMNGS試劑盒，嚴格按照說明書分別對第1例樣本的I1-5’UTR全長序列和第2例樣本的3’UTR-5’UTR全長序列進行特異性擴增、定量、文庫構建、乳化PCR產物等，最后上ION S5TM測序儀進行測序，將所得序列用TypeStream VisualTMNGS Analysis Software軟件進行數據處理和分析。

1.4.5單鏈測序方法 根據PCR-SBT結果，針對需要做的位點選擇相應的單鏈擴增引物進行擴增并測序，嚴格按照說明書分別對第1例樣本的HLA-DRB1*07位點、第2例樣本的HLA-DQB1*03和HLA-DQB1*04位點進行單鏈測序反應，并對結果進行分析。

2 結果

2.1 常規PCR-SSO/SBT分型結果第1例先證者PCR-SSO分型結果無異常探針反應。PCR-SBT分型結果分別為HLA-A*02:01，30:01；B*13:02，15:02；C*06:02，08:01；B1*02:02,03:01；DRB1位點相對于DRB1*07:01,12:02序列在第2外顯子237位有1個堿基不匹配，由堿基G>R(A+G),二次復核無改變。結果見圖1。第2例先證者PCR-SSO分型結果無異常探針反應。PCR-SBT分型結果分別為HLA-A*11:01，24:02;B*13:01，15:01；C*03:04，04:01；DRB1*04:05,04:06。DQB1位點相對于DQB1*03:02，04:01的基因序列，在第2外顯子256位有1個堿基不匹配，由堿基G>R(A+G)，經兩次復核無改變。結果見圖2。

2.2 NGS及單鏈測序確證結果分別應用NGS及單鏈測序方法對第1例先證者的HLA I1-5’UTR全長序列、DRB1*07單鏈進行測序，兩種方法均證實DRB1*07序列在第2外顯子237位發生了G>A堿基突變，結果見圖3(NGS)、圖1。分別應用NGS及單鏈測序方法對第2例先證者的HLA3’UTR-5’UTR全長序列、DQB1* 04單鏈進行測序，兩種方法均證實DQB1*04序列在第2外顯子256位發生了G>A堿基突變，結果見圖4(NGS)、圖2。

圖1 第1例先證者DRB1位點測序結果

圖2 第2例先證者DQB1位點測序結果

圖3 第1例先證者NGS測序結果

圖4 第2例先證者NGS結果

2.3 家系調查分析根據基因測序分型結果，在征得本人知情同意后，對與第1例先證者有姐妹關系的兩位供者及其女兒進行HLA-DRB1位點測序分析，結果顯示兩位姐妹的HLA-DRB1結果均為04:03,12:02；其女兒的HLA-DRB1結果為12:02,14:04，可以判定先證者的HLA-DRB1*12:02遺傳于父母，但由于無法獲取先證者父母血樣，所以HLA-DRB1*07的突變是直接來自于父母遺傳還是自身突變有待考證；其女兒的HLA-DRB1* 12:02遺傳自先證者，突變未遺傳給其女兒。先證者4位家庭成員的分型結果見圖5。第2例先證者因個人原因只有先證者及其同胞患者兄妹兩人進行HLA分型實驗，且其同胞患者分型結果與之全不相合，未能進行家系遺傳情況分析。

注：黑色為先證者

2.4 新等位基因與同源性最高的等位基因序列比對及命名經BLAST比對，發現第1例先證者的未知基因序列與其同源性最高的DRB1*07:01:01相比，第2外顯子第79位密碼子由GTG>GTA，編碼的氨基酸由纈氨酸Val(v)>纈氨酸Val(v),為同義突變。新基因與DRB1*07:01:01的核苷酸及氨基酸比對見圖6。第2例先證者的未知基因序列與同源性最高的等位基因DQB1* 04:01:01相比，未知基因第2外顯子第86位密碼子由GGG>AGG，編碼的氨基酸由甘氨酸Gly(G)>精氨酸Arg(R)，為非同義突變。新基因與DQB1*04:01:01的核苷酸及氨基酸比對見圖7。將2例先證者所檢測序列上傳至Genbank后分別獲得的Bankit ID(MN295058)和(MN295056)及相關數據提交給WHO HLA因子命名委員會，被正式命名為HLA-DRB1* 07:01:23(HWS10056299)和HLA-DQB1* 04:74(HWS10056295)。

圖6 HLA-DRB1*07：01:23與HLA-DRB1*07:01:01:01的核苷酸(部分)及氨基酸序列比對圖

圖7 HLA-DQB1*04：74與HLA-DQB1*04:01:01:01的核苷酸(部分)及氨基酸序列比對圖

3 討論

人類HLA基因位于人類第6號染色體的短臂(6p21.31)，DNA片段長度約為3 600 kb，占人基因組的1/3000。一般按HLA復合體在染色體上的排列分為HLA-Ⅰ類、HLA-Ⅱ類和HLA-Ⅲ類3個區。經典的HLA基因位于HLA復合體的HLA-Ⅰ類區和HLA-Ⅱ類區內，與移植排斥反應和合成蛋白質抗原功能有密切關系。為HLA-Ⅰ類分子α鏈編碼的Ⅰ類基因和為HLA-Ⅱ類分子的β鏈編碼的B基因是目前已知的多態性最為豐富的HLA基因。

隨著聚合酶鏈反應(PCR)擴增技術和測序技術的應用，HLA分型實驗已經由開始的血清學、細胞學階段提升到更為精確的分子生物學階段。目前，應用于HLA檢測的主要技術有PCR-SSP、PCR-SSO、DNA測序、基因芯片等[1]。PCR-SSO技術具有靈敏度高、特異性強、所需樣本量少等特點，適合大批樣本的 HLA分型初篩。但其無法直接反映基因序列，如果在陰性和陽性磁珠上的探針熒光強度處于臨界值，則可能出現結果誤判[2-5]。基于測序的SBT檢測方法能夠直接從堿基水平得到HLA的等位基因序列，原始數據的準確率高達99%[6]，是目前HLA分型檢測公認的金標準，具有高通量、高分辨率的特點[7-8]。但是由于HLA基因的多態性、等位基因的同源性和實際測序區域的限制性(兩個或多個等位基因在所檢測區域序列一致、該測定區域存在多種等位基因組合或者兩者差異在所檢測區域之外等)等，HLA每個位點等位基因的數量逐年增多，模棱兩可結果的比例也隨之增高。當出現罕見等位基因或無完全匹配結果時，在排除實驗原因后，可能提示疑似新等位基因，尤其出現不可修改的單峰變雙峰或雜合峰 A 變雜合峰 B情況時，應高度懷疑新等位基因。此類結果的解決方案一般包括換用其他方法(如高分辨PCR-SSP方法進行精確分型)、組特異性引物單鏈擴增、特異性引物測序、增加外顯子測序范圍、NGS等[9]。NGS能夠在短時間內同時對上百億堿基進行測序[10]，等位基因漏失現象變的不太可能，也避免了PCR-SBT中的模棱兩可，使得罕見型和新等位基因的鑒定相對容易。其測序成本相對較低，耗時相對較短，在工作量大、時間緊迫時相對于傳統的一代測序分型有明顯優勢[11]。然而 NGS 測序儀器及配套產品需要進口，價格昂貴，各實驗室需要結合自身的實際情況選擇適合的測序方法。隨著NGS成本的降低和準確度的提高，其分型技術正逐漸成為基因診斷領域的主導技術[12]。

本文中2例先證者樣本在PCR-SSO檢測基因分型時探針反應格局均正常，無異常探針反應，提示該方法針對已知等位基因設計的探針存在漏檢新等位基因的風險。SBT是對DNA雙鏈的雙向測序，無法確定突變位于哪條DNA鏈上。為準確區分突變位置，進一步對第1例先證者的HLA-DRB1*07和第2例先證者的HLA-DQB1*03,-DQB1*04進行組特異性單鏈測序，并應用NGS進行測序確證。最終分別確定了新等位基因HLA-DRB1*07:01:23和HLA-DQB1*04:74的堿基序列，而新等位基因來源于家系遺傳、個體突變或與疾病有關尚待研究。

目前國際上已檢出HLA-DRB1*07位點136種，其中3種被列入中國CWD表(2.4版)；已檢出HLA-DQB1*04位點110種，其中4種被列入中國CWD表(2.4版)。DRB1*07、DQB1*04與疾病的相關性研究已有諸多報道。在多項對慢性乙型病毒性肝炎、乙型肝炎病毒后肝硬化、肝癌等的研究中，JiangYG[13]等報道提示HLA-DRB1*07可能為機體感染乙型肝炎病毒后慢性化持續性感染過程的危險因素；El-Chennawi等[14]研究發現，HLA-DRB1*07、DRB1*04為埃及肝癌發生的危險因子,而DRB1*15為其保護性因子。Lin等[15]進行的Meta分析證實DRB1*07、12是所有人群原發性肝癌的易感基因，而DRB1*15等位基因可能是亞洲人群肝癌的易感基因。另有研究提示，伊朗人中肺結核病與DRB1*07基因型密切相關[16]。一項對廣西壯族女性HPV16感染和宮頸癌易感性的關聯研究中發現HLA-DQB1*04等位基因是廣西壯族女性宮頸癌發生的易感基因，而HLA-DQB1* 06/09則相反，是其保護基因[17]。中國人Ⅰ型糖尿病(DM1)的易感性單倍型是DQB1*0401，DQB1*0405也可能與DM1發病相關[18];DQB1*0402是摩洛哥人DM1的易感基因，而在牙買加人中，DQB1*0402 則與DM1疾病的保護有關[19]。以上文獻均證實，HLA基因型與多種疾病的密切相關性，準確的HLA分型是研究和臨床應用的基礎。

隨著NGS技術在HLA分型實驗中的應用，使得新等位基因被有效識別并快速鑒定，其被發現的數量也必將大幅提升。新等位基因的發現豐富了世界基因庫，增加了HLA系統多態性，為人類群體遺傳和進化分析提供了寶貴的數據資料，并對臨床移植配型、法醫學親子鑒定、個體識別、輸血醫學及相關性疾病研究提供了基本數據，具有重要意義。