胃食管反流病動物模型的研究進展

陳 棒,王 丹,趙 希

(吉林大學第一醫院 胃腸內科，吉林 長春130021)

胃食管反流病(GERD)是臨床常見病，燒心和反流是其典型癥狀，根據黏膜損傷程度又進一步分為反流性食管炎(RE)，非糜爛性反流病(NERD)及巴雷特食管(BE)[1]。GERD的病因和發病機制尚未完全闡明，目前認為是多種因素造成的以食管下括約肌功能障礙為主的胃食管動力障礙性疾病。而GERD相關動物模型的制備對于發病機制的研究、診斷及篩選治療藥物等方面具有重要的臨床價值。其中RE因其存在器質性病變，易于通過動物模型研究其發病機制，故而在有關GERD的動物實驗中應用較多。本文對與GERD動物模型制備相關的方法及評價綜述如下。

1 建立GERD動物模型

目前GERD動物模型的制備主要包括三種基本類型：自然模型，外科模型和遺傳模型[2]。自然模型是指通過外源性灌注化學反流成分誘導食管炎。外科模型是通過外科手術改變動物胃腸道自然解剖結構誘導食管炎，包括胃反流、混合反流、十二指腸反流和食管移植。而遺傳模型則是通過基因改造而制備的轉基因小鼠模型，常用于巴雷特食管和食管腺癌(EAC)動物模型的建立。此外，近年來通過內鏡干預如內鏡下環形肌切開制備GERD動物模型等，為GERD大型動物模型制備提供了一種新穎、微創、成功率較高的方法選擇。

1.1 自然模型

自然模型是指通過外源性食管灌注(EEP)誘導食管炎。食管灌注方法主要用于一些短期制備GERD動物模型的實驗，是指將食管上皮暴露于某些化學溶液(如酸、膽鹽、胃蛋白酶等反流物)，控制反流物的濃度和暴露時間，目的是明確反流液對食管黏膜的損傷因子及其作用機制。Li 等[3]設計了一種允許持續輸注測試物質或藥物的長期給藥方法：在食管上部插管，連接到皮下滲透微泵，通過手術放置的插管將膽汁和酸以一定的速率連續灌注到食管腔，觀察到7d后即可引起RE的組織細胞學損傷。王宏偉等[4]通過混合灌注鹽酸和豬膽汁建立了家兔GERD模型，對比生理鹽水灌注組，灌注操作后分別對食管黏膜進行肉眼觀察、HE染色光鏡下病理觀察及電鏡下細胞超微結構觀察。該實驗操作未破壞動物食管、胃、十二指腸的生理解剖結構，在較短時間內成功制備了家兔GERD模型。Pardon等[5]設計了一種活體兔食管灌注模型，將55只麻醉家兔，分別用pH7.2、pH5.0[包括含200 μM和500 μM脫氧膽酸(DCA)]、pH1.0的不同溶液灌注食管30 min，然后分別于灌注后即刻、24 h、48 h時處死動物，通過檢測食管黏膜細胞的跨上皮電阻、上皮細胞間隙擴張和細胞凋亡情況，發現含有DCA的弱酸性溶液可誘導上皮細胞凋亡，并對黏膜完整性造成長期損害。此類急性食管灌注建模實驗操作流程相對簡單，術后動物存活率高，但由于人體內反流物成分復雜，實驗灌注成分相對單一，無法精確模擬RE形成的自然病理過程[6]。

1.2 外科模型

手術制備GERD動物模型是通過胃腸道手術建立模型，屬于慢性實驗，主要用于明確長期食管內反流的病理變化及發病機制，是建立RE、NERD及巴雷特食管模型較為普遍的手段之一。目前主要術式包括：胃反流、混合反流、十二指腸反流和食管移植等。

1.2.1胃反流 王強等[7]應用5月齡新西蘭大白兔先進行不潔飲食法和刺激法3周誘導胃排空障礙，3周后使用球囊擴張法破壞兔食管下括約肌，設計了一種同時具備食管下段抗反流屏障缺陷以及胃排空功能障礙的新型GERD動物模型。Silva等[8]標準化了手術誘導小鼠NERD的動物實驗模型：在靠近幽門的十二指腸周圍放置硅化無毒環，以促進幽門狹窄，限制胃排空(不完全阻斷十二指腸腔)，并結扎胃底和胃體之間的過渡區，以限制胃的順應性，術后通過觀察炎癥情況、食管黏膜的完整性、以及使用PPI的效果對模型進行評估，為NERD相關的病理生理機制研究提供了幫助。謝勝等[9]比較了賁門鋼圈置入固定術(固定鋼圈于鞘管上，沿食管將鋼圈送于賁門處，再用魚線縫合固定)和食管氣囊擴張術兩種建立大鼠反流模型的術式，兩種術式均可成功建立大鼠GERD模型，但賁門鋼圈置入固定術實驗組的大鼠自第二周開始出現鋼圈脫落，可能是固定線不耐腐蝕及縫合方式不佳所致，大鼠模型維持時間短，實用性差，實驗術式有待進一步改進。

1.2.2混合反流 已知的混合反流模型有三種：食管-十二指腸吻合術(EDA)、食管-空腸吻合術(esophagus-jejunal anastomosis，EJA)和食管-空腸、胃-空腸吻合術(EJGJ)[10]。EDA模型是將食管下括約肌與十二指腸起始部(距幽門1 cm)之間進行端端吻合，保留迷走神經，使胃分泌物與十二指腸分泌物一起經吻合口反流入食管，EDA模型可以很好的模擬GERD患者的反流狀態。然而，在EDA模型中，十二指腸液反流減少，難以誘發巴雷特食管[11]。EJA模型是在食管下段和空腸起始部之間進行端端吻合，并保留迷走神經，使所有來自胃和十二指腸的液體都可以流入食管下段。然而，在EJA模型中，反流太劇烈，不能模擬巴雷特食管患者由慢性胃食管反流誘發的真實情況。在EJGJ模型中，胃液從胃排入空腸，與十二指腸液混合流入食管下段，EJGJ模型綜合了EDA和EJA模型模擬人類GERD的病理生理狀態。

Theisen等[11]采用轉基因大鼠通過食管十二指腸端側吻合術誘導十二指腸分泌物向食管的外科分流，然后將每只轉基因大鼠暴露在化學致癌物(如亞硝胺)或十二指腸胃反流中16周，成功構建了GERD的EDA動物模型，其中亞硝胺處理使乳糖操縱子調節基因(LacI)突變頻率增加近20倍，出現的特異性突變明顯高于偶然預期，并與人類食管腺癌p53突變中發現的相似，提示反流物與人類食管腺癌的發生可能有關。Kanai等[12]在進行宿主因素對巴雷特食管癌變的影響研究中，不切除胃而直接行EJA術式，構建了小鼠、大鼠胃十二指腸反流模型：剖腹后切斷食管胃連接部，將殘胃連續縫合，在食管斷端和距幽門環約2 cm的空腸上端之間進行端側吻合。張濤[13]等將75只大鼠隨機分為實驗組和對照組，將實驗組大鼠食管下段切斷，在距離幽門0.5 cm位置處切斷十二指腸，并將十二指腸斷端、食管斷端自空腸起始處依次端-側吻合至空腸壁上，成功建成EJGJ反流模型，模擬了GERD患者反流性食管炎-巴雷特食管-EAC的整個發展過程。此外，Wen等[10]將EJGJ模型進行了優化改進：延長胃空腸吻合口和食管空腸吻合口的距離，使胃液與十二指腸液能很好地混合，同時為避免梗阻，在食管下段將平行切口改為斜切口，增加了食管-空腸吻合口長度，以上兩種改良方法提高了存活大鼠巴雷特食管的發生率，并有效降低大鼠因梗阻致死的術后并發癥。

1.2.3十二指腸反流模型和食管移植模型 He等[14]和Arcidiacono等[15]在混合反流的基礎上于食管胃連接部切斷并結扎食管，幽門處切斷并結扎十二指腸，進行空腸-食管端側吻合，去掉整個胃，建立了十二指腸反流模型。王瑞華等[16]分別建立了大鼠EDA模型、EJA模型及十二指腸反流模型，術后觀察大鼠的一般情況和食管病變情況，發現3種術式的模型組均出現程度不同的反流性食管炎，其中EJA模型組、EDA模型組食管病變較重，且巴雷特食管發生率均高于十二指腸反流模型組。王學偉等[17]采用5種不同術式建立大鼠食管膽汁反流模型，發現5種反流模型均能依次導致反流性食管炎-巴雷特食管-巴雷特食管上皮不典型增生和腺癌、或鱗癌和腺-鱗癌，提示反流性食管炎-巴雷特食管-食管腺癌的發生模式存在，且膽汁反流是病因之一。

巴雷特食管有發生腺癌的可能，表現為食管下段黏膜的鱗狀上皮細胞被柱狀上皮細胞所取代，是GERD的并發癥。Watanabe等[18]采用8周齡大鼠為實驗動物，分別將大鼠不同部位的正常黏膜組織移植到大鼠十二指腸中，觀察移植到十二指腸部位的正常組織阿利新藍PAS染色，結果發現移植到十二指腸部位的正常組織中均可見杯狀細胞，呈綠色熒光蛋白(GFP)陽性，黏蛋白陽性，邊緣有堿性磷酸酶活性，該實驗結果表明組織內的干細胞具有多分化潛能，當移植到不同的部位時，可以轉分化為該部位相應的器官組織。該實驗中，移植到十二指腸壁上的大鼠前胃正常黏膜組織發生腸化生可能源于鱗狀上皮細胞的轉分化，食管移植實驗對巴雷特食管起源的研究將提供新的途徑[19]。

1.2.4其他與GERD有關的研究 Bahadr等[20]研究大鼠腹腔鏡手術中腹內壓(IAP)持續時間對GER的影響時得出結論，長時間的腹腔鏡手術可能導致GER。該實驗結果可為今后制備GERD動物模型時提供輔助方法和新思路。

外科模型無論采用何種術式，優點是建模效率高，接近GERD的解剖學發生機制，適用于病因和發病機制研究；但該類方法操作過程復雜，創傷大，改變了動物生理解剖結構，影響存活率，而且僅強調影響胃排空障礙的解剖學改變，無法模擬其他功能性因素對食管胃動力的改變。熟練的模型制備技巧對建模成功率至關重要，在制備過程中應注意：(1)實驗動物術前禁食時長應大于24小時，保證胃排空，減少術后腹腔感染;(2)術中開腹后應保持消化道通暢，避免扭曲成角;(3)游離下段食管時避免損傷迷走神經;(4)注意縫合方式、縫合線種類及線頭留用的長短，避免吻合口漏或嚴重出血;(5)為避免術后腹腔污染嚴重、增加實驗動物死亡率，可于術前預防性使用抗生素[21]。

1.3 遺傳模型

近年來通過基因改變制備GERD模型也開始受到關注，遺傳模型多用于巴雷特食管和食管腺癌動物模型的建立。小鼠模型非常適合于分子基因研究，因為小鼠基因組已經完全測序，有許多學者嘗試利用轉基因和異種移植小鼠模型來研究巴雷特食管[2]。Hao等[22]對野生型p53A135V轉基因小鼠和A/J株INK4a/Arf+/-小鼠進行反流手術，其中，一些小鼠還接受奧美拉唑(飲食中加入奧美拉唑的濃度為1400 ppm)、鐵(50 mg/kg/m，注射或口服)或胃切除加鐵的治療，結果實驗中沒有一只小鼠患上食管腺癌，他們的研究認為手術誘導的胃食管反流可導致小鼠食管鱗狀細胞癌，而不是食管腺癌。抑癌基因p53、p27和p16在人EAC中經常發生突變或丟失。p53-/-和p27-/-小鼠對手術誘導的巴雷特食管和EAC更敏感，p16-/-進行反流手術的小鼠只誘導了鱗狀細胞癌，而不是EAC[19]。目前遺傳模型的研究有限，仍需要更大范圍的驗證。

1.4 內鏡干預模型

有研究[23]選用6頭肉豬，采用經口內鏡下隧道技術于齒狀線上方5 cm處切開食管全層，術前、術后均行食管造影，觀察造影劑通過食管下段時的阻力變化，結果發現食管下段在手術前后無明顯縮窄或增寬，術后造影劑通過順利，而食管下括約肌張力明顯松弛，從而建立了一種微創、新穎的內鏡下GERD大動物模型制備方法。Alshehri等[24]通過切開豬食管下括約肌制備GERD模型，并于內鏡下注射右旋糖酐透明質酸共聚物(DxHA)于食管下括約肌，發現注射DxHA可引起成纖維細胞和巨細胞的異物反應，增強食管下括約肌的抗反流屏障功能，對GERD有潛在的治療作用。

孫賢久等[25]選取健康6-12月齡的實驗犬，通過內鏡下切開環行肌的手術方法制備GERD模型，觀察比較操作前后7天的食管壓力、食管pH值測定及處死后光鏡下食管組織病理改變，成功建立了反流模型。該實驗建模成功率較高且不破壞實驗動物的解剖結構，較好地還原了反流性食管炎的病理發生機制，可能成為未來研究內鏡下抗反流治療的新型動物模型制備方法。

2 模型評價

GERD的診斷方式多種，包括癥狀學診斷、胃鏡檢查[色素內鏡、 放大內鏡、 窄帶成像(NBI)、共聚焦激光纖維內鏡、i-scan 技術等新顯像模式的特殊內鏡]、食管pH監測(24 h食管pH監測、食管阻抗-pH監測以及無線食管 pH 膠囊監測)、質子泵抑制劑(PPI)診斷性試驗、高分辨率食管測壓、食管鋇劑造影、胃腸超聲造影、唾液胃蛋白酶原檢測等[26]。受限于動物實驗的獨特性和局限性，目前GERD動物模型制備的檢測方式多采用建模后病理觀察食管黏膜病變，包括肉眼下、HE染色光鏡下、電鏡下等觀察食管黏膜炎性病變，判斷反流建模成功與否。借鑒GERD患者的診斷方式，可以將24 h食管pH監測、食管阻抗-pH監測以及高分辨率食管測壓等技術應用于GERD動物模型制備的監測評價中，從而提高對動物模型評價的敏感性，減輕食管病理取材對動物的損傷，同時有助于提高建模成功后動物的生存時間和利用率。

3 理想動物模型

目前大多數GERD模型是通過人為實驗操作建立的，Glover等[27]報道了一種可以表現出自然發生GERD癥狀的已知物種，該實驗收集了8只活檢組織病理診斷為GERD的狒狒進行了回顧性研究，分析已知危險因素對疾病發展的影響程度(如飲酒、高脂飲食等)，首次報道了GERD可以在任何非人類靈長類物種中自然發生，并指出狒狒在解剖學和生理學上與人類相似，可能是研究GERD的一種較理想的動物模型。所謂理想的動物模型[2]應符合三個基本標準：(1)與人的遺傳具有相關性；(2)食管胃連接部的解剖學與人類相似性；(3)自然發生病理生理學導致的GERD。小鼠和人類食管之間的組織學差異是這些手術模型的固有局限性。如果用于研究巴雷特食管和食管腺癌，可能需要將反流手術和基因改造或添加外源性致癌物結合起來，以提高建模成功率。

4 結論

現有GERD動物模型制備方式有不同程度的食管病變形成，但任何一種模型都具有內在的局限性，需要熟練掌握模型操作技術，提高建模成功率，降低動物術后死亡率并有效降低成本，同時選擇更可靠的模型評估手段如pH監測等方式進行驗證。根據實驗目的選擇合適的制備模型方法并提高模型質量，開發更簡便、經濟、有效的造模方法將是今后GERD動物模型研究的主要方向。