釀酒酵母中BAT2基因敲除對桑葚酒中高級醇的影響

徐佳,黃雪芹,楊建飛,易媛,馬倩,胡琨,左勇,*

1(四川輕化工大學 生物工程學院,四川 宜賓,644000) 2(四川師范大學 生命科學學院,四川 成都,610000)

桑葚酒是一種以桑葚汁為原料經酵母發酵而成的果酒[1],含有豐富的花青素,具有補血、明目等功效[2],已成為繼葡萄酒之后的第二大類果酒[3]。高級醇作為果酒風味物質的骨架成分,在桑葚酒中不僅能夠起到呈香呈味的作用,還是構成酯類的前體物質,但含量過高,則會導致酒中產生異雜味,飲后還會造成口渴、頭痛等現象[4]。果酒中高級醇含量超過400 mg/L時,會明顯加重酒中的辛辣刺激感[5],而目前我國市售的桑葚酒中,高級醇含量大都在400 mg/L以上[6],因此嚴格控制桑葚酒中的高級醇含量對提高桑葚酒品質具有重要意義。

高級醇作為桑葚酒釀造過程中釀酒酵母產生的次級代謝產物,其中含量最高的是異丁醇和異戊醇,主要由:支鏈氨基酸分解途徑(Ehrlich途徑)[7]和糖代謝合成途徑(Harrsi途徑)[8]產生。果酒中有25%的高級醇來自Ehrlich途徑,在此途徑中由BAT2基因編碼的細胞質支鏈氨基酸轉氨酶是第一步關鍵酶[9]。LI等[10]通過敲除BAT2基因,降低了白酒中28.85%的高級醇含量;ZHANG等[11]通過敲除BAT2基因,使黃酒中異丁醇和異戊醇分別降低了33%和14.2%。但目前國內針對降低桑葚酒中高級醇含量的研究仍集中在工藝條件的優化[12]和外源添加物的選擇[13]等方面,采用基因工程的手段,從分子水平改造酵母降低桑葚酒中高級醇的研究尚屬空白,對二倍體酵母中的等位基因進行單、雙缺失來逐步降低桑葚酒中高級醇的研究更為少見。

本文以實驗室前期從桑葚自然發酵液中選育的優良二倍體釀酒酵母S3為出發菌株,分別敲除1個BAT2等位基因和2個BAT2等位基因后,對敲除菌株進行發酵試驗,研究BAT2基因缺失對桑葚酒發酵過程中高級醇生成量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質粒

實驗中所用菌株和質粒如表1所示。

表1 實驗中所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids in this study

續表1

1.1.2 引物

根據NCBI公布的釀酒酵母S.cerevisiaeS288c 的BAT2基因序列,設計PCR引物,如表2所示。

表2 實驗中所用引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 試劑與儀器

限制性內切酶,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Taq聚合酶、Pfu酶、T4 DNA連接酶,近岸蛋白質科技有限公司;遺傳霉素(G418)和博來霉素(Zeocin),北京索萊寶科技有限公司;酵母基因組 DNA 提取試劑盒、純化回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒,北京艾德萊生物科技有限公司;引物由擎科生物技術有限公司合成；標準品正丙醇、異戊醇、異丁醇、2-苯乙醇(純度均>99.5%,GC),上海麥克林生化有限公司。

PCR 基因擴增儀(5020),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;臺式高速離心機(D3024),大龍興創實驗儀器(北京)股份公司;電泳儀(DYY-8C),北京六一生物科技有限公司;氣質聯用儀(6890 N-5975B),美國Agilent公司;恒溫恒濕箱(GZ-250-HS11),韶關市廣智科技設備有限公司;恒溫水浴鍋(HWS-12),上海喬欣科學儀器有限公司;凝膠成像系統(Gel DocTMXR+),伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.1.4 主要培養基

LB培養基,YEPD培養基,半乳糖誘導培養基 (將YEPD 培養基中葡萄糖改為半乳糖即可)[14]。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質粒的構建

通過1.1.2中的引物,以原始菌株S3的基因組為模板擴增BAT2基因的上下同源臂片段BA、BB和BAT2基因中的部分片段BA1、BB1,再以 pUG6質粒為模板擴增KanMX片段。然后以酶切連接法依次連接到質粒 pUC19 上獲得重組質粒。

1.2.2 酵母轉化

將擴增片段利用醋酸鋰轉化法[15]轉化進釀酒酵母S3,涂布于含500 μg/mL G418的YEPD抗性平板,30 ℃培養48 h后,對平板上生長的單菌落進行PCR驗證。

1.2.3KanMX抗性基因的去除

為敲除BAT2兩個等位基因,需反復利用KanMX抗性基因作為篩選標記。采用Cre/loxP系統,去除陽性轉化子中的KanMX篩選標記基因:先將pSH65質粒成功轉入陽性子后接入半乳糖誘導培養基誘導4～5 h,再利用影印平板法篩選 G418 抗性陰性轉化子,最后進行PCR驗證。

1.2.4 pSH65質粒的丟失

pSH65質粒中的Cre重組酶發揮作用后,需將其從菌株中移除,以防止其中的Cre重組酶會在后續的敲除試驗中提前表達。將帶有pSH65質粒的目的菌株,接入10 mL無抗YEPD液體培養基中,傳至8～10代,PCR驗證是否丟失質粒。

1.2.5 發酵實驗

取斜面菌種一環接種到滅菌后的20 mL桑葚果汁中,25 ℃,180 r/min 振蕩培養24 h后,以10%接種量轉接到200 mL桑葚果汁中,25 ℃,180 r/min 振蕩培養18～24 h。再以5%的接種量接入調整好成分后的200 mL桑葚果汁中,25 ℃恒溫無氧發酵5 d。

1.3 分析方法

1.3.1 生長曲線

取斜面菌種1環,接到10 mL YEPD液體培養基中,30 ℃,180 r/min 培養12 h。再以1% 接種量轉接至200 mL YEPD液體培養基繼續培養,每隔2 h測定600 nm處的吸光值。

1.3.2 理化測定

CO2失重:按照文獻[16]描述的方法每隔12 h稱重1次;酒精度:采用比色法[17];還原糖:采用斐林試劑法;總酸:參照GB/T 15038—2006 葡萄酒、果酒通用分析方法，采用電位滴定法。

1.3.3 高級醇的測定

1.3.3.1 氣相色譜的條件

采用外標法根據各組分峰面積定量計算各組分含量。色譜條件參照文獻[13]調整為:毛細管柱J&W 122-7062 DB-WAX(60 mm×0.25 mm,0.25 μm);柱溫40 ℃保持3 min,然后以4 ℃/min升至77 ℃,保留1 min,以4 ℃/min升至97 ℃,保留1 min,以4 ℃/min升至107 ℃,保留1 min,以6 ℃/min升至132 ℃,保留1 min,以15 ℃/min升溫至230 ℃,保持5 min;進樣器溫度230 ℃;檢測器溫度230 ℃,無分流進樣;載氣He,恒流1.0 mL/min。

1.3.3.2 標準溶液的配制

根據文獻[18]中的方法進行調整,準確量取異戊醇0.5 mL、異丁醇0.2 mL、正丙醇和苯乙醇各0.1 mL于100 mL容量瓶中,用體積分數12%的乙醇溶液(色譜級無水乙醇與超純水配制)定容,得到混合標準儲備液。

再分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 mL混合標準儲備液于10 mL容量瓶,用體積分數12%乙醇溶液定容,配制成不同濃度的混合標準溶液待進樣,根據各物質峰面積,對質量濃度進行一元線性回歸分析,繪制標準曲線。

1.3.3.3 樣品前處理

取50 mL桑葚酒樣品與50 mL蒸餾水于250 mL蒸餾瓶中蒸餾,得到45 mL蒸餾液后,以蒸餾水定容至50 mL,為待測樣品。

2 結果與討論

2.1 重組菌株S3-1的構建

2.1.1 構建獲得敲除質粒pUC-BAKB

按酶切連接法構建重組質粒pUC-BAKB,其流程及結果見圖1。

圖1 重組質粒pUC-BAKB的構建流程圖Fig.1 Flow chart for the construction of plasmid pUC-BABK

2.1.2 重組菌株S3-1的驗證

以重組質粒pUC-BAKB為模板擴增片段BAKB,經1.2.2法轉化到出發菌株S3后得到陽性轉化子S3G,同源重組過程如圖2所示。然后以出發菌株S3的DNA為陰性對照,以1-F/1-R 和2-F/2-R為上下游驗證引物,對S3G進行PCR驗證。結果如圖3所示,對照菌S3無條帶;重組菌株S3G上游為542 bp,下游為731 bp,與預期條帶大小一致。證明KanMX片段已成功整合到出發菌株S3的基因組上,整合位點正確,BAT2基因被敲除。

圖2 同源重組過程Fig.2 The process of homologous recombining

M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株S3G中重組片段BAKB的上游驗證;2-重組菌株S3G中重組片段BAKB的下游驗證;3-出發菌株S3中重組片段BAKB的上游驗證;4-出發菌株S3中重組片段BAKB的下游驗證圖3 重組菌株S3G的PCR驗證Fig.3 PCR verification of the recombinant strain S3G

2.1.3KanMX抗性篩選標記的去除

利用1.2.3的方法,去除存在于S3G基因組上的KanMX抗性基因,經抗性平板篩選后,得到無抗性標記基因的重組菌株S3-1,如圖4-a所示。

a-左:含G418抗性的YEPD平板;右:普通YEPD平板;b-M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株S3G中KanMX基因片段的擴增;2-重組菌株S3-1中KanMX基因片段的擴增圖4 重組菌株S3-1的驗證Fig.4 Verification of the recombinant strain S3-1

S3-1的PCR驗證結果如圖4-b所示,以K-F/K-R為引物,重組菌株S3G為模板,能夠擴增出1 631 bp的KanMX抗性基因片段;以重組菌株S3-1為模板,無法擴增出目的條帶,證明重組菌株S3-1基因組中已無KanMX抗性基因。

2.1.4 pSH65質粒的丟失

將重組菌株S3-1連續傳代至pSH65質粒丟失,以Z-F/Z-R為引物,PCR驗證如圖5所示,相比第1代S3-1,第8代S3-1無明顯條帶,表明S3-1傳至第8代時已丟失pSH65質粒。

M-2 kbp DNA Marker;1,2,3-重組菌株S3-1第1,5,7代中Zeocin抗性基因的擴增;4,5-重組菌株S3-1第8,9代中Zeocin抗性基因的擴增圖5 pSH65質粒丟失后的PCR驗證Fig.5 PCR verification for the curing of plasmid pSH65

2.2 重組菌株D3-1的構建

為提高同源重組效率,采用縮進式[19]基因整合的方式,以BAT2基因中的一部分作為同源臂(BA1和BB1)進行實驗。

2.2.1 重組質粒pUC-BA1KB1的構建

采用酶切連接法構建重組質粒pUC-BA1KB1,構建流程方法同2.1.1。

2.2.2 重組菌株的驗證

對菌株S3-1進行BAT2基因的2次敲除,操作流程同2.1.2。得到陽性轉化子D3G后,通過3-F/3-R和4-F/4-R進行PCR驗證,結果如圖6所示,條帶符合預期大小,證明KanMX片段已成功整合到出發菌株S3-1的基因組上,第2個BAT2等位基因被敲除。

M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株D3G中重組片段BA1KB1的上游驗證;2-重組菌株D3G中重組片段BA1KB1的下游驗證;3-出發菌株S3-1中重組片段BA1KB1的上游驗證;4-出發菌株S3-1中重組片段BA1KB1的下游驗證圖6 重組菌株D3G的PCR驗證Fig.6 PCR verification of the recombinant strain D3G

2.2.3KanMX抗性篩選標記的去除

將菌株D3G的KanMX抗性基因去除后得重組菌株D3-1,流程同2.1.3,抗性平板篩選結果見圖7-a,PCR驗證結果見圖7-b,證明重組菌株D3-1基因組中已無KanMX抗性基因。

a-左:含G418抗性的YEPD平板;右:普通YEPD平板;b-M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株D3G中KanMX基因片段的擴增;2-重組菌株D3-1中KanMX基因片段的擴增圖7 重組菌株D3-1的驗證Fig.7 Verification of the recombinant strain D3-1

2.2.4 pSH65質粒的丟失

將重組菌株D3-1連續傳代,以Z-F/Z-R為引物,PCR驗證如圖8所示,D3-1傳至第8代時也已丟失pSH65質粒。

2.3 重組菌株的生長性能比較

以出發菌株S3為對照,測定重組菌株S3-1和D3-1的生長曲線。如圖9所示,重組菌株S3-1的生長趨勢與S3一致,無明顯差異;而重組菌株D3-1的生長速率和生物量較S3均有下降,這可能是由于BAT2基因完全敲除后菌株對支鏈氨基酸的吸收能力受到了影響,從而減緩了菌體的生長速率[20]。

M-2 kbp DNA Marker;1-重組菌株D3-1第1代中Zeocin抗性基因的擴增;2,3-重組菌株D3-1第8,9代中Zeocin抗性基因的擴增圖8 pSH65質粒丟失后的PCR驗證Fig.8 PCR verification for the curing of plasmid pSH65

圖9 重組菌株S3-1、D3-1及出發菌株S3的生長情況Fig.9 The growth of strains S3,S3-1 and D3-1

2.4 重組菌株的發酵性能比較

將重組菌株S3-1、D3-1和出發菌株S3,同時進行桑葚酒發酵試驗,發酵結束后比較各菌株的基本發酵性能。結果如表3所示,重組菌株S3-1、D3-1與出發菌株S3在相同條件下CO2失重、總酸、還原糖含量以及酒精度均無明顯差異(P>0.05),且都符合NY/T 1508—2017 綠色食品 果酒。表明BAT2基因的缺失對菌株的基本發酵性能無顯著影響。

表3 重組菌株S3-1、D3-1及出發菌株S3的發酵性能比較Table 3 Comparison of fermentation properties of strains S3,S3-1,D3-1

2.5 重組菌株的醇酯含量比較

參照方法1.3.3測定重組菌株和出發菌株發酵液中的高級醇含量,結果如圖10所示。相比于出發菌種S3,重組菌株的高級醇含量均有所下降,其中單敲除重組菌株S3-1的總高級醇降低了20.97%,為359.33 mg/L;雙敲除重組菌株D3-1降低了31.63%,為310.85 mg/L,達到了250～350 mg/L的適宜范圍[21]。其中,異丁醇和異戊醇下降明顯(P<0.01),S3-1分別降低了27.42%、22.86%,D3-1分別降低了40.53%、35.28%;而丙醇和苯乙醇無明顯變化(P>0.05),與LI等[10]的研究相似。

圖10 重組菌株S3-1、D3-1和出發菌株S3的發酵醪中高級醇生成量的比較Fig.10 Comparison of high alcohol yields in fermented mash of strains S3,S3-1,D3-1注:總高級醇含量為丙醇、異丁醇、異戊醇和苯乙醇含量之和;不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

BAT2基因的缺失可以使釀酒酵母的高級醇產量減少,并且BAT2等位基因的第2次敲除對釀酒酵母高級醇代謝仍具有顯著影響(P<0.05)。主要原因可能如下:(1)D3-1生物量的降低導致其產生的高級醇含量減少;(2)BAT2的缺失影響了Ehrlich途徑中的第一步反應—轉氨作用,阻斷了釀酒酵母細胞質中纈氨酸和亮氨酸轉化為α-酮酸[22],減少了異丁醇和異戊醇的前體物質,從而降低高級醇含量。并且當出發菌株為二倍體時,BAT2作為等位基因在基因組中會有2個拷貝,所以敲除基因的數量會與高級醇的含量呈負相關。但研究高級醇時,其含量并不是越低越好,當其含量過低時,酒體單薄,不利于果酒的風味和口感;含量過高時又會危害人體,所以達到適宜濃度的高級醇才是果酒的研究目的。

3 結論

本研究利用Cre/loxp系統和基因同源重組技術,對出發菌株S3的BAT2基因進行單敲除和雙敲除,得到重組菌株S3-1和D3-1。經生長性能的測定,S3-1的生長趨勢與S3一致,但D3-1較S3有所減緩。桑葚酒發酵實驗結果顯示,S3-1和D3-1的基本發酵性能與S3均無明顯差異,符合果酒釀造的基本要求。而高級醇生成量相比出發菌株有不同程度的降低,S3-1降低了20.97%,D3-1降低了31.63%,其中降低最為明顯的是異丁醇和異戊醇。這表明對釀酒酵母中BAT2基因的敲除可以在不影響基本發酵性能的同時,降低桑葚酒中高級醇含量,提高桑葚酒品質,具有一定的實際應用潛力。本研究僅探究了BAT2基因對高級醇生成量的影響,在后續研究中可以繼續探究BAT2基因對相關氨基酸轉化量和桑葚酒中其他風味物質生成量的影響,完善BAT2基因在高級醇代謝途徑中的作用機制。