cf-DNA聯合CD11b對HIV陰性肺孢子菌肺炎患者預后評估的價值

張環 陶小根

肺孢子菌肺炎(pneumocystis jirovecii pneumonia，PCP)是HIV感染者常見的機會性感染。近年來由于器官移植技術的發展、惡性腫瘤患者的不斷增多以及糖皮質激素/免疫抑制劑的廣泛應用，PCP在免疫功能低下的HIV陰性患者中的發病率逐漸上升[1]。部分HIV陰性PCP可迅速進展為重癥肺炎，引起不可逆的呼吸衰竭，病死率可達26%～64%[2]。中性粒細胞是機體先天免疫的重要成分，其表面黏附分子CD11b與CD62L是中性粒細胞活化的標志物，介導中性粒細胞與內皮細胞的黏附，促使中性粒細胞向炎癥處聚集。NETs是中性粒細胞在各種刺激下活化，細胞核內DNA及抗菌顆粒蛋白等物質釋放到胞外所形成的網狀結構[3]。NETs可通過殺滅病原體而發揮其生物學效應，但過度釋放可加重炎癥反應導致周圍組織損傷。本研究旨在探討NETs水平、中性粒細胞表面黏附分子CD11b、CD62L表達以及APACHE Ⅱ評分對HIV陰性PCP患者預后的預測價值。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年6月至2020年12月間在中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院)住院的60例HIV陰性PCP患者，診斷依據2016年第五屆歐洲白血病感染會議(ECIL)制定的血液病/惡性腫瘤患者和干細胞移植受者肺孢子菌肺炎診斷標準[4]：新發的呼吸道癥狀；胸部影像學可見新發的肺泡浸潤影或彌漫性磨玻璃影；痰液或支氣管肺泡灌洗液(BALF)六胺銀染色發現肺孢子菌包囊和/或肺孢子菌DNA陽性。納入標準：符合PCP診斷標準；年齡≥18周歲；HIV檢測結果陰性者；臨床資料完整者。排除標準：HIV/AIDS患者；合并有肺孢子菌之外其他真菌感染者；重要數據缺失者；隨訪缺失者；已常規用藥預防者。依據ECIL指南進行規范化治療[5]，足量應用復方磺胺甲噁唑，根據臨床療效及時聯合克林霉素或卡泊芬凈治療，依據病情需要，采用機械通氣或血液凈化治療。根據患者住院28d預后結局分為存活組(38例) 、死亡組( 22 例) 。本研究經醫院倫理委員會批準(2020KY倫審第228號)，研究對象或家屬簽署知情同意書 。

二、方法

1. 血指標測定:分別于治療前收集外周靜脈血2mL，全自動血細胞分析儀(Sysmex,日本)測定檢測白細胞計數、中性粒細胞計數、淋巴細胞計數；同時收集靜脈血5mL，進行離心處理后獲得上清液，分別應用免疫比濁法、放射免疫學分析法測定患者C反應蛋白(CRP)及降鈣素原(PCT)水平。剩余血標本用于后續指標檢測。

2. 中性粒細胞表面黏附分子CD11b、CD62L檢測: 采集各組外周血1mL加入EDTA抗凝管，用人中性粒細胞分離試劑盒(北京索萊寶公司)提取中性粒細胞后重懸細胞，分別加入BV421抗CD62L(美國BD公司)，BV510抗CD11b(美國Biolegend公司)流式細胞抗體0.5ul，混勻轉管后行流式細胞儀檢測。流式細胞術分析采用流式細胞儀軟件(美國新澤西州富蘭克林湖生物科學中心)。

3. cf-DNA/NETs檢測: 使用PicoGreen dsDNA Quantitation Kits(美國Invitrogen公司)測定：①采集外周靜脈血1mL，離心后取上清至于-20℃保存；②用TE緩沖液將PicoGreen稀釋成1×染料工作液避光儲存備用；③制作標準曲線：用TE工作液將100ug/mLDNA儲存液稀釋成2ug/mL DNA標準品工作液，按照濃度依次為1000、100、10、1、0ng/mL倍比稀釋各梯度標準品溶液，將標準品溶液與PicoGreen 熒光染料工作液室溫避光孵育5min后用熒光酶標儀檢測各梯度標準品熒光值，根據標準品的濃度及對應的熒光值制作標準曲線；④將待測樣本血清50ul與PicoGreen 熒光染料工作液100ul避光孵育5min后熒光酶標儀檢測各樣本熒光值；根據標準曲線計算樣本cf-DNA/NETs水平。

4. 采用APACHE Ⅱ評分系統評估PCP患者病情: 入院24h內采用 APACHE Ⅱ評分評估患者病情。APACHE Ⅱ評分系統包括3個部分: 急性生理評分、慢性健康評分、年齡評分，總分71分。分值越高，對應病情越嚴重。

三、統計學方法

結 果

一、存活組、死亡組一般資料比較

存活組與死亡組性別、年齡、基礎疾病、是否使用糖皮質激素或免疫抑制劑、住院激素使用情況、白細胞計數、CRP水平均無顯著差異(P>0.05)，死亡組中性粒細胞計數、PCT水平、APACHEII評分高于存活組，淋巴細胞計數低于存活組，差異均有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 一般資料及入院24h內相關指標

二、存活組與死亡組中性粒細胞表型的表達

檢測兩組PCP患者外周血中性粒細胞表面CD62L和CDllb分子MFI的表達。死亡組外周血白細胞(PBNs)活化指標CD11b高于存活組，熒光強度分別為(11681.23±1882.45.vs. 9435.26±1224.01；P<0.001)，差異有統計學意義(見圖1A,C)，CD62L兩組之間差異無統計學意義(P>0.05)(見圖1B,D)。

圖1 兩組PCP患者PBNs CDllb、CD62L表達的比較(***P<0.001，有統計學意義；ns：P=0.146，差異無統計學意義)

三、存活組、死亡組血漿cf-DNA/NETs水平

死亡組cf-DNA/NETs含量高于存活組，分別為(2282.50±458.38ng/mL .vs. 1497.05±466.15ng/mL；P<0.001)，差異具有統計學意義(見圖2)。

四、預后相關影響因素分析

以患者預后作為因變量(賦值方法：存活=1，死亡=0)，將CD11b、cf-DNA/NET水平按四分位數間距轉換為四分類變量資料，二元Logistic回歸分析在相互校正單因素分析有意義的指標后，結果顯示CD11b、cf-DNA、APACHE Ⅱ評分每增加一個單位，死亡風險分別增加138.5%(P=0.019)、166.7%(P=0.011)和35.6%(P=0.002)，而淋巴細胞每增加一個單位，死亡風險降低77.%(P=0.004)(見表2)。

表2 相關因素對預后的預測價值

五、相關影響因素對患者預后的效能比較

CD11b聯合cf-DNA的ROC曲線下面積(area under ROC curve，AUC)大于單獨使用CD11b、cf-DNA或APACHE Ⅱ評分，提示聯合檢測的預測價值較大，敏感度為95.5%，特異度為89.5%。(見圖3、表3)。

表3 各指標對PCP患者28d預后的預測價值

圖3 各指標預測PCP患者28d預后的ROC曲線

討 論

發生在HIV陰性免疫低下人群的肺孢子菌肺炎常伴有病情重、病死率高等特點，造成了嚴重的社會經濟負擔，探尋其預后影響因素具有重要的臨床意義。APACHE Ⅱ評分是臨床常用于評估病情嚴重程度的評分方法，可通過估計病死率來預測患者預后。既往研究發現APACHE Ⅱ評分與HIV陰性PCP患者的預后密切相關[6]，在本研究中我們也得出了類似的結果，Logistic分析還提示APACHE Ⅱ評分每升高1分，患者死亡風險增加35.6%。

中性粒細胞在受到病原微生物刺激后能夠通過釋放NETs來殺滅病原體，但過度的NETs也可以造成周圍組織的損傷，目前已被證實NETs可能參與了多種肺部疾病的發生發展過程，如重癥肺炎、COVID-19、ARDS等[7-9]。Gaborit等[10]曾發現PCP患者中性粒細胞計數的升高，但未進一步報道NETs在PCP中的變化。本研究通過測定外周血cf-DNA/NETs濃度，發現HIV陰性PCP患者外周血中NETs水平顯著增高，這與在其他肺部疾病中觀察到的結構類似[7-9,11]。通過回歸分析還發現cf-DNA/NETs與預后相關，可作為患者預后的預測因素，其靈敏度及特異度均較好。我們推測NETs的增高可能由孢子菌在肺內產生的細胞免疫反應引起中性粒細胞聚集所導致，但過度的NETs直接導致肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞的損傷，NETs水平越高，其損傷程度越重，死亡風險越高。

本研究通過對比患者資料發現，PCP患者淋巴細胞計數低于參考范圍，且死亡組較存活組更低，與既往報道結果類似[12]，淋巴細胞作為體內主要的免疫細胞，其總數的減少也反映了機體細胞免疫功能的減退，而且初始淋巴細胞的減低是PCP患者死亡的獨立危險因素[13]。當細胞免疫功能受損時，巨噬細胞及T細胞免疫缺陷，機體無法將孢子菌由肺泡內清除，巨噬細胞也無法清除過多的NETs，也可能導致NETs的異常增多。

CD11b是一種選擇性表達于白細胞表面的黏附分子，能夠使中性粒細胞由血管內皮細胞游出，向炎癥部位聚集，被認為是中性粒細胞活化的標志[14]，也是疾病預后的不良因素[15]。本研究中，我們觀察到在HIV陰性PCP患者中CD11b的表達顯著增高，與在VAP患者中觀察到的變化一致[16],但該試驗未進一步探討其與預后的關系，我們的研究對比了死亡組和存活組CD11b表達水平，顯示死亡組CD11b表達更多。CD11b的高表達更有利于中性粒細胞的滲出、聚集[17]，從而釋放更多的NETs，組織損傷進一步加重，ROC曲線提示CD11b可作為患者預后的獨立預測因素。

本研究由于標本量有限，結果可能存在偏倚，而且部分病例依賴PC-DNA診斷，可能存在假陽性結果，同時我們也未對HIV陰性PCP患者體內中性粒細胞凋亡和清除標志物作進一步檢測，無法了解到NETs對PCP患者的中性粒細胞凋亡的影響，相關情況仍有待后續進一步觀察。

綜上，APACHE Ⅱ評分、CD11b、cf-DNA/NETs對HIV陰性PCP患者預后有一定預測價值，其中CD11b+cf-DNA聯合預測效能最佳。