去整合素金屬蛋白酶15通過AKT/ERK通路和MMP9影響肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲

周潔琦 徐圣杰 高莉蓉 劉澤毅

肺癌是導致癌癥相關性死亡的主要原因[1]，肺癌的發病率和死亡率均位于全球首位[2]。盡管有針對非小細胞肺癌(NSCLC)的多種治療方法，對于晚期患者療效仍然有限，五年生存率仍然較低[3]。因此，迫切需進一步研究NSCLC的發病機理，并尋找有效的治療方法。去整合素金屬蛋白酶(ADAM)屬于去整合素金屬蛋白酶家族成員，包括信號肽，前肽，金屬蛋白酶域，去整合素域等區域，在調節細胞與細胞和細胞與基質的相互作用中起到重要作用[4-5]。研究表明ADAM15在許多實體惡性腫瘤中表達上調，且ADAM15的高表達與腫瘤的發生和轉移有關，提示ADAM15高表達的患者預后較差[4, 6]。因此，本研究旨在探討ADAM15對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其可能的機制，旨在為肺癌的治療提供新的靶點。

資料與方法

一、組織樣本

收集2016至2018年蘇州大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科20對肺癌組織及相應的癌旁組織樣本。所有患者術前均未經放化療和介入等治療。此研究經蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會批準[2016倫理(申報)批第157-1號], 并獲得所有涉及此研究患者的知情同意。

二、實驗試劑

Trizol、RT-PCR試劑盒及SYBR Green RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；ADAM15引物(蘇州金唯智科技有限公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑(賽默飛公司)；ADAM15干擾序列(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；Cell counting kit-8(CCK8)試劑(碧云天公司)；RPMI-1640培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；結晶紫染液(上海生工公司)；ADAM15抗體(Santa Cruz公司)、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK、MMP2、MMP9抗體(CST公司)；β-actin抗體、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京康為世紀生物科技有限公司)。

三、細胞培養

人肺癌細胞系A549、H1299、SPC、H460及人正常肺上皮細胞BEAS-2B均從上海中國科學院細胞庫購買。細胞均在含有10%FBS和1%雙抗(100U/ml青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640的完全培養基中，37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養。

四、瞬時轉染

將H460細胞接種在六孔板中，當細胞密度達到40%～60%時，我們按照制轉染試劑盒說明書使用Lipofectamine 2000進行轉染。48～72 h后，收集細胞用于進一步實驗。AMAM15的干擾序列如下：ADAM15-1 siRNA：5′-CCCAGC UGUCACCCUCGAA-TT-3′; ADAM15-2 siRNA：5′-GAUCUACUCUGGGAGA CAATT-3′。

五、實時熒光定量PCR

嚴格按照Trizol試劑說明提取細胞總RNA，并進行反轉錄及RT-PCR檢測。ADAM15上游引物：AGCCTCAAAAAGGTGCTTCA，下游引物：TGGTAGCA GCAGTTCTC；β-actin的上游引物：CACAGAGCCTCGCCTT TGCC，下游引物：ACCCATGCCCACCATCAC。

六、CCK8細胞增殖實驗

根據CCK8試劑說明書，使用CCK-8試劑檢測細胞的增殖能力。將H460細胞以每孔3×103個細胞的密度接種在96孔板中，每孔設計3個復孔，分別在鋪板后24、48、72 h加入10ul CCK8試劑，繼續放到培養箱中培養2h，然后用酶標儀測定細胞在450nm和630nm的光密度值(OD值)。

七、劃痕實驗

將H460細胞接種在6孔板中，轉染48 h，待細胞密度達到90%后，使用10 μl移液器吸頭以及無菌標尺輕輕、緩慢地在水平線劃一條劃痕，垂直線劃三條劃痕。用PBS洗后換無血清培養基后繼續培養48h。在顯微鏡下分別在0h和48h取同樣的位置進行拍照。

八、小室(Transwell)檢測遷移和侵襲

將H460細胞接種在6孔板中，轉染48 h，待細胞密度達到90%。消化細胞進行計數，然后用含1% FBS的培養基重懸。向基質膠包被的小室上室加入200 ul含12×104細胞的細胞懸液，向基質膠未包被的小室上室加入200ul含8 ×104細胞懸液，下室均加入800ul完全培養基。培養24h，取出小室，PBS洗滌后甲醇固定30min，再用結晶紫染色2h，用棉棒輕輕擦去上室面細胞，于顯微鏡下觀察拍照并計數。

九、蛋白質印記(Western blot)檢測蛋白

轉染H460細胞系后使用RIPA法提取細胞總蛋白并制作蛋白樣品。以每孔50ug蛋白樣品加樣，用濕轉法將蛋白轉至NC膜上，一抗4°過夜孵育，TBST洗4次/5 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗4次/5 min，顯影檢測蛋白表達。

十、統計學分析

結 果

一、OSluca網站預測各數據庫中ADAM15與肺癌的預后的關系

通過Osluca網站(http://bioinfo.henu.edu.cn/LUCA/LUCAList.jsp)中的多個數據庫分析了ADAM15對肺癌預后的影響，結果顯示在大多數數據庫中風險比(HR)大于1，表明ADAM15可能與肺癌的預后不良有關(圖1)(P<0.05)。

圖1 OSluca預測各數據庫中ADAM15與肺癌預后的關系

二、ADAM15在肺癌細胞株和肺癌組織中呈高表達

通過Western blot的檢測，ADAM15在正常肺上皮細胞株BEAS-2B和肺癌細胞株A549、H1299、SPC、H460中相對表達水平(圖2A)，定量如(圖2B)。由于ADAM15在H460細胞株中表達較高，故選擇H460細胞株進行后續實驗。使用實時定量PCR在肺癌組織和相應的癌旁組織中也檢測ADAM15的表達，在20對肺癌組織和相應的癌旁組織中，ADAM15在13對肺癌組織中呈高表達，占比65%(圖3)(t=2.226，P=0.038)。

圖2 ADAM15在肺癌細胞株中呈高表達注：A:Western blot檢測了ADAM15在人支氣管上皮細胞BEAS-2B，以及肺癌細胞A549, H1299, SPC和H460中表達水平(n=3, 每個實驗獨立重復3次); B：為左圖的蛋白定量圖(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001)

圖3 實時熒光定量PCR檢測了ADAM15在肺癌組織和相應的癌旁組織的中的表達水平(n=20,*P<0.05)

三、ADAM15影響H460細胞的增殖，遷移和侵襲

圖4 CCK8實驗反應了H460細胞干擾ADAM15后各組間的細胞增殖能力(n=3, 每個實驗獨立重復3次，***P<0.001)

圖5 劃痕實驗反映了H460細胞干擾ADAM15后各組間的細胞遷移能力(×40)(n=3, 每個實驗獨立重復3次)

四、ADAM15對相關信號通路的影響

在H460細胞中干擾ADAM15后，檢測增殖和轉移有關的相關蛋白的變化，結果表明，磷酸化的AKT和ERK的表達隨著ADAM15的干擾顯著下降，但總的AKT和ERK的表達并沒有顯著變化。隨著ADAM15的干擾，基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達也顯著下降，然而，基質金屬蛋白酶2(MMP2)的表達并沒有明顯變化(圖7A)，定量如(圖7B)，具體參數(見表1)。

圖7 ADAM15對相關信號通路的影響注：A: Western blot檢測了H460細胞干擾ADAM15后各組間ADAM15和下游蛋白的表達水平，β-actin作為內參(n=3, 每個實驗獨立重復3次); B:為左圖的蛋白定量圖(**P<0.01; ***P<0.001)

表1 H460細胞增殖和轉移相關的蛋白相對定量

討 論

據報道，ADAM15在許多惡性腫瘤中表達上調，且ADAM15的高表達與腫瘤的發展和轉移有關[6-7]。然而，在某些癌癥中，例如結腸癌，ADAM15表達的降低與結腸癌患者的癌癥轉移和預后不良有關[8]，因此，我們認為ADAM15在各種類型的癌癥中起著不同的作用。在我們的研究中，我們發現ADAM15在肺癌組織中的表達高于癌旁組織，并且我們通過大數據分析觀察到ADAM15的高表達與肺癌患者的不良預后相關。

ADAM15是一種位于細胞膜上的金屬蛋白酶，它是唯一在其去整合素結構域中具有RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)位點的ADAM家族成員，它可以通過與整合素αVβ3，α5β1結合而在細胞粘附中發揮作用[5, 9-10]，因此，ADAM15是否可以通過整合素介導的信號通路進而在肺癌的發生發展中發揮作用值得進一步探討。

磷酸肌醇3激酶(PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，作為多種重要基因，如表皮生長因子受體(EGFR)的下游通路，已經被證明對肺癌的增殖具有重要作用[11-13]。MMP2和MMP9屬于MMP家族的成員可以降解膠原蛋白和凝膠，和腫瘤的轉移和侵襲有關[14-17]。歐小波等人證明ADAM15可以通過影響MMP9促進乳腺癌侵襲，并將兩者聯合作為評估乳腺癌惡行生物學行為的指標[18]。本研究證明ADAM15通過調控PI3K-AKT和MAPK-ERK信號通路影響H460細胞的增殖，并且ADAM15被干擾后，MMP9的表達隨之減少，而MMP2的表達無明顯變化，表明ADAM15可能通過調控MMP9通路影響H460細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，ADAM15的下調可以抑制H460細胞的增殖、遷移和侵襲，這將為肺癌的治療提供新的線索。