SPP1在非小細胞肺癌中的表達差異及機制研究

張丹丹 徐健

肺癌為一種呼吸系統常見惡性腫瘤，肺癌在全球癌癥發病率和死亡率中排名第一[1]。肺癌可分為：小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC占肺癌的80%～85%，主要病理類型為肺腺癌和肺鱗癌[2]。盡管在過去30年中肺癌治療和生存方面取得了進展，但肺癌患者生存狀況的改善相對較小，促使人們對肺癌治療的新模式進行了研究。目前基因靶向治療及免疫治療取得了一定進展，但早期診斷和治療對于肺癌非常重要。因此有必要探索新的治療靶點，更能有效改善患者預后。

分泌磷蛋白1(SPP1)又稱骨橋蛋白，研究發現，SPP1基因參與消化系統腫瘤發生及轉移[3-4]，其高表達與腫瘤的發生發展明顯相關[5]。有關SPP1在NSCLC中的表達以及預后研究較少，我們擬通過一系列在線數據庫，分析SPP1在NSCLC中的作用，探索其內在機制。

資料和方法

一、SPP1表達水平分析

首先通過Oncomine數據庫分析SPP1在不同類別腫瘤中表達水平，P-value=1E-4，Fold change=2。其次，通過GEPIA和Ualcan數據庫了解SPP1在NSCLC表達情況。

二、SPP1蛋白-蛋白網絡分析

通過STRING數據庫查找NSCLC中與SPP1表達關聯的蛋白，采用蛋白-蛋白相互作用進行網絡分析。

三、通過WebGestalt數據庫對與SPP1相互作用的基因進行功能富集分析和KEGG信號通路分析。

四、生存分析

通過Kaplan-Meier plotter分析SPP1基因分別在高表達和低表達NSCLC患者中生存情況，以總生存期(Overall Survival，OS)、首次進展生存期(First Progression ，FP)為生存分析的指標。

五、免疫浸潤分析

六、統計分析

差異表達、蛋白網絡等采用在線軟件分析。生存數據采用log-rank檢驗，P<0.05為有統計學差異。

結 果

一、SPP1基因表達

在Oncomine數據庫中，SPP1在大多數腫瘤中存在高表達。在GEPIA和Ualcan數據庫中，SPP1在肺腺癌和肺鱗癌中表達也是明顯升高的(圖1)。

二、SPP1 蛋白-蛋白相互作用網絡

通過STRING在線工具進行PPI網絡分析，找到50個與SPP1相互作用的蛋白(AFP、AHSG、ALB、AMBN、AMELX、AMTN、APOA1、APOE、BGLAP、BMP4、C3、CD44、CDH2、CP、CSF1、CST3、CYR61、DMP1、ENAM、FAM20A、FAM20C、FBN1、FGF23、FN1、GOLM1、GPC3、IBSP、IGFBP1、IGFBP3、IGFBP5、IGFBP7、IL6、ITGA5、ITGA9、ITGAV、ITGB1、ITGB3、ITGB5、MEPE、MFGE8、MMP3、MMP7、MSLN、PDGFB、RHOA、RUNX2、RUNX3、SPARCL1、TIMP1、VCAN)(圖2)。

三、富集分析和KEGG分析

對與SPP1相互作用的基因進行富集分析和KEGG分析結果顯示，在biological process前三的分別為metabolic process，biological regulation，multicellular organism process在 cellular component前三位的分別為endomembrane system，endoplascmic reticulum，extracellular space。在molecular function方面，protein binding，ion binding，enzyme regulator activity。KEGG分析提示：ECM-receptor interaction，Focal adhesion，PI3K-Akt signaling pathway排名前三位(圖3)。

四、生存分析

在肺腺癌中，SPP1低表達組患者OS和FP明顯高于高表達組，差異有統計學意義(P均<0.05)。在肺鱗癌患者中，SPP1高表達組患者OS低于低表達組 (P<0.05 )(圖4)。

五、免疫浸潤分析

討 論

分泌磷酸蛋白1 (SPP1)，又稱骨橋蛋白(OPN)，是一種母細胞蛋白，它是一種磷酸化的富含唾液酸的非膠原骨基質蛋白，屬于整合素小結合N糖蛋白(SIBLING)家族。SPP1蛋白由SPP1基因編碼，該基因位于人類4號染色體(4q21 4q25)上，由7個具有高度保守啟動子的外顯子組成[6]。大量研究表明，腫瘤中SPP1的表達與預后差和總生存期短有關。它在腫瘤的侵襲、遷移、血管生成、炎癥和轉移等過程中，發揮重要作用[7]。惡性細胞中調控SPP1表達的確切分子機制尚不清楚。已有研究表明，SPP1通過細胞ECM(細胞外基質)的相互作用以及通過與整合素和CD44結合來調節信號通路來促進腫瘤發生[5]。

越來越多研究發現，SPP1在腫瘤和正常組織中表達存在差異，在多種腫瘤中表達上調，并且和臨床病理及預后相關。Xu等人的研究發現，結腸癌中SPP1表達顯著上調，SPP1通過激活EMT促進結腸癌的轉移，可能成為結腸癌患者潛在的治療靶點[8]。Choe等人研究發現，結腸癌中SPP1表達是上調的，SPP1的上調與結腸癌生存率下降相關[9]。Chen等人研究表明，SPP1過表達與低級別膠質瘤患者較差的總生存率相關[10]。此外，SPP1被認為是低級別膠質瘤的獨立因素。Liang的研究發現SPP1與乳腺癌的發生風險相關，提示調控SPP1的表達，促進BRC的發生發展[11]。G?thlin Eremo等人研究發現，SPP1 mRNA是乳腺癌強有力的預后標志物[12]。而SPP1在非小細胞肺癌中的表達研究較少，我們通過多個數據庫分析SPP1在肺癌中的表達差異以及SPP1在非小細胞肺癌中發生發展中的內在機制，以期對非小細胞肺癌的臨床診治提供新的生物靶點。

我們研究中發現，在Oncomine數據庫中SPP1在膀胱癌、腦及中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤中表達升高。SPP1可能參與多種腫瘤的發生。通過對GEPIA和Ualcan數據庫的分析，我們發現SPP1在肺腺癌和肺鱗癌表達明顯增高，表明SPP1在可能參與非小細胞肺癌的調控。對SPP1進行蛋白-蛋白互作分析，我們發現SPP1與AFP、AHSG、ALB等50種蛋白存在相互作用。為了研究其作用通路，我們對上述50種蛋白和SPP1進行功能富集分析和KEGG分析，我們發現，其主要富集在多種生物過程和代謝調節，也是符合SPP1在腫瘤中的發生、發展中的機制。生存分析發現，肺腺癌和肺鱗癌中SPP1低表達患者，OS均增加，預后較好。因此，SPP1不僅是非小細胞肺癌發生的標志物，而且也是預后重要的標志物。Tu 等人研究也發現，SPP1在多種腫瘤中表達升高，也與多種腫瘤預后相關[13]。Yang等人對肺腺癌的基因表達數據集分析發現，SPP1和其共表達的1個基因可作為肺腺癌的診斷、治療靶點和預后指標[14]。為了進一步研究SPP1在非小細胞肺癌中的相關機制，我們分析了SPP1與腫瘤免疫細胞浸潤的關系，發現SPP1與多種腫瘤免疫細胞浸潤正相關，SPP1影響非小細胞肺癌患者預后，可能與SPP1介導的腫瘤免疫細胞浸潤有關。最后我們通過非小細胞肺癌的腫瘤免疫浸潤細胞的COX回歸生存分析，也證實B cell，Dendritic cell和SPP1高表達與肺腺癌患者生存率下降有關。Liu等人研究也證實，SPP1在肺癌組織和細胞系中高表達。SPP1高表達可通過抑制肺癌細胞自噬和凋亡，顯著促進肺癌細胞的生長[15]。因此SPP1可能是非小細胞肺癌重要的生物標志物，有望成為新的治療靶點，但還需要分子生物實驗進一步驗證。