孕期膽堿缺乏影響子代宮內生長及糖脂代謝的動物模型 研究

吳潔，張黎黎，李艷紅，張嫻，寸麗蘋

(昆明醫科大學第二附屬醫院，云南 昆明 650101)

0 引言

膽堿是人體必需營養素之一，其主要生理功能包括：神經傳導、生物膜的信號傳遞、脂肪轉運和一碳代謝[1]。盡管膽堿較為廣泛的存在于日常膳食中，但由于膳食不均衡、膽堿代謝關鍵酶基因多態性差異、孕期和哺乳期需求量相對增加等原因，導致大部分孕婦的膳食膽堿攝入量未達到適宜攝入量[2]。孕期膽堿攝入不足不但影響孕婦自身健康，而且干擾胎兒代謝穩態，影響子代健康。有研究提示膽堿補充可以拮抗肥胖小鼠的胰島素抵抗發生，孕期補充膽堿可拮抗能影響妊娠期糖尿病所導致的子代脂代謝紊亂，提示孕期膽堿水平可能影響子代的糖脂代謝穩態。現實狀況中膽堿缺乏較為常見，本研究擬構建孕期膽堿攝入不足的跨代動物模型，探討孕期膽堿攝入不足對子代糖脂代謝的影響。

1 材料

1.1 實驗動物

選用7周齡C57BL/6小鼠，動物登記為SPF級，雌性20只，雄性10只，由上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部購進，實驗動物許可證: SCXK(滬)2018-0006，墊料、飼料由上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部提供。實驗場所由上海市實驗動物研究中心提供。動物飼養條件：溫度24°C-26°C，空氣濕度40%-70%，12h光照/黑暗循環，標準小鼠箱飼養，實驗過程中小鼠均自由攝食飲水，適應性喂養1周后開始造模。

1.2 主要試劑

實驗動物的膽堿缺乏飼料購自美國Research Diets公司。小鼠血清胰島素采用酶聯免疫吸附試劑盒為美國Bio TSZ Trust Specialty Zeal 公司的小鼠胰島素ELISA試劑盒。

2 孕期不同膽堿攝入的實驗動物模型構建方法

2.1 母鼠膽堿營養狀態及分組

7周齡C57BL/6J小鼠正常飲食喂養適應1周后，按照雌雄比2:1的比例合籠，合籠后以觀察到雌鼠陰栓確認懷孕。確認懷孕后孕鼠單籠飼養并隨機分組，給予不同膽堿含量的飼料喂養。由于市場尚無不同膽堿含量的動物飼料，僅有無膽堿飼料，因此采用無膽堿飼料添加不同含量的氯化膽堿以導致不同程度的膽堿攝入不足。根據既往研究報道，小鼠標準飼料的膽堿含量是1.4g氯化膽堿/kg飼料。將孕鼠隨機分為組：A組：給予標準膽堿飲食(無膽堿飼料+1.4g氯化膽堿/kg飼料)，B組：給予1/2標準膽堿飲食(無膽堿飼料+0.7g氯化膽堿/kg飼料)，C組：給予1/4標準膽堿飲食(無膽堿飼料+0.35g氯化膽堿/kg飼料)，D組：給予無膽堿飲食(無膽堿飼料，不添加氯化膽堿)。所有小鼠均自由攝食、攝水。每周稱量并母鼠妊娠期每周測量一次體重及攝食量(攝食量=總飼料量-剩余飼料量-撒料)。

表2 不同膽堿攝入組孕鼠所生小鼠的糖脂代謝指標(±s)

表2 不同膽堿攝入組孕鼠所生小鼠的糖脂代謝指標(±s)

指標組別 血糖(mmol/L) 胰島素(μU/mL) 總膽固醇(μg/μL) 甘油三酯(mmol/L) HOMO-IR A組 3.29±1.25 0.89±0.18 1.56±0.34 1.29±0.17 0.12±0.02 B組 3.76±0.98 1.09±0.24 1.90±0.44 1.67±0.81 0.23±0.06 C組 3.03±1.07 1.32±0.43 1.77±0.90 1.29±0.17 0.23±0.09 D組 2.98±1.25 1.06±0.09 1.86±0.34 1.94±0.36 0.16±0.03 P值 0.671 0.344 0.787 0.940 0.598

2.2 子代糖脂代謝異常的模型構建

新生子鼠出生后，麻醉后處死，從眼眶靜脈叢采血，立即4000r/min，常溫離心5min后取血清，置于-80℃冰箱保存進行血清胰島素、血糖、甘油三酯、總膽固醇的測定。

2.3 糖脂代謝指標的測定和評估

小鼠血清胰島素采用酶聯免疫吸附(ELISA)方法測定，試劑盒為美國Bio TSZ Trust Specialty Zeal 公司的小鼠胰島素ELISA試劑盒，操作方法嚴格按照試劑盒操作說明書進行。血糖、甘油三酯、總膽固醇采用美國貝克曼AU5800(BECKMAN COULTER AU5800)全自動生化分析儀測定。采用穩態模型胰島素抵抗指數(Homeostasis model assessment - insulin resistance, HOMA-IR)來評估新生子鼠的胰島素敏感性，HOMA-IR=空腹胰島素(uU/mL)×空腹血糖(mmol/L)/ 22.5[3]。

2.4 統計學分析

數據錄入采用Excel軟件錄入，再導入SPSS 23.0 統計軟件進行統計分析。計量資料且服從正態分布的用±s描述，不同膽堿營養水平組別的指標比較使用單因素方差分析(One Way ANOVA)，多組均數兩兩比較采用LSD法。以α=0.05為檢驗顯著性標準。

3 結果

3.1 母鼠孕期體重增長和攝食情況

四組不同膽堿營養飼養組母鼠孕期體重增長有明顯統計學差異，D組孕鼠的孕期增重明顯低于A組小鼠，平均每天攝食量亦差異無統計學意義(表1)。

表1 不同膽堿攝入組別母鼠孕期增重和攝食量比較(±s)

表1 不同膽堿攝入組別母鼠孕期增重和攝食量比較(±s)

注：a孕期增重=分娩當日體重-確認懷孕時體重，4組小鼠孕期增重比較，差異具有統計學意義，兩兩比較結果顯示A組和D組的差異具有統計學意義(P=0.01)。b平均攝食量=(總飼料量-剩余飼料量-撒料)/懷孕天數，4組小鼠孕期平均攝食量比較P=0.34。

指標組別 A組 B組 C組 D組a孕期增重(g) 5.40±0.79 5.77±0.98 4.92±0.65 4.63±0.5 b平均攝食量(g/d) 8.23±0.82 7.78±0.64 8.06±0.98 7.98±0.83

3.2 孕期膽堿攝入不足對新生小鼠出生體重的影響

采用比較4組新生小鼠的出生體重，結果顯示(見圖1)：單因素方差分析結果顯示不同組別新生小鼠的出生體重存在差異(F=3.467，P=0.019)，兩兩比較結果顯示孕期無膽堿飲食組(D組)所生的小鼠出生體重(1.47±0.33)g明顯低于標準膽堿飲食組(A組)(1.89±0.47)g(P=0.023)。

圖1 不同孕期膽堿營養組新生子鼠出生體重比較

3.3 孕期膽堿攝入不足對新生小鼠糖脂代謝生化指標的影響

比較不同膽堿攝入組別孕期所生小鼠的糖脂代謝指標，結果顯示新生新生小鼠的血糖、胰島素、總膽固醇、甘油三酯、HOMO-IR差異無統計學意義(P>0.05)。

4 討論

最近美國的一項膳食調查發現僅有10%的普通人群和8%的孕婦滿足他們相應性別和生理階段所需的膽堿適宜攝入量[4]，英國的一項孕婦的膳食調查結果顯示僅有18%的孕婦膳食膽堿攝入達到適宜攝入量[5]。均提示孕婦人群中膽堿攝入不足并不少見，但孕期膽堿攝入不足對胎兒的影響知之甚少。

本研究構建了孕期小鼠膽堿攝入不足和缺乏的跨代動物模型，探討孕期膽堿攝入對子代健康的影響。結果發現：孕期膽堿攝入缺乏孕鼠所生新生子鼠的出生體重明顯降低，提示孕期膽堿攝入缺乏可能會影響胎兒體重。該結果與西班牙的一項人群研究結果類似，該研究發現低出生體重兒的臍血膽堿水平較低[6]。膽堿在膽堿脫氫酶的作用下，通過氧化反應形成甜菜堿，在同型半胱氨酸甲基轉移酶的催化下，提供一個甲基形成體內通用的甲基供體——S-腺苷甲硫氨酸(Sadenosylmethionine，SAM)，廣泛參與后續的DNA、蛋白質等甲基化過程。基于膽堿的此種代謝機制，推測孕期膽堿攝入不足可通過影響子代的甲基化修飾，導致表觀遺傳遺傳改變，從而影響胎兒的宮內生長發育[7]。其中的機制可能與孕期膽堿營養可影響胎盤功能有關。有研究提示對胎盤功能受損的小鼠模型的雌鼠交配前5天開始補充不同劑量(1、2、4倍)的膽堿，結果發現補充4倍膽堿劑量可以增加妊娠早期和中期的胎鼠和胎盤重量[8]。提示孕期膽堿營養可能通過影響胎盤功能，從而影響子代宮內生長發育。

本研究構建了孕期小鼠膽堿攝入不足和缺乏影響子代健康的跨代動物模型，可為下一步從表觀遺傳學機制探討孕期膽堿對胎兒生長發育的影響機制研究構建基礎。由于膽堿在脂肪酸的分解代謝、脂肪細胞的合成、肝臟的脂肪轉運過程中有著至關重要的作用[9]。因此，母親孕期膽堿狀態可能影響血脂水平，影響胎盤供給胎兒的血脂狀態，從而影響胎兒的脂代謝[10,11]。同時有動物實驗提示膽堿、甜菜堿與胰島素抵抗存在相關性[12-14]。基于以上提示，本研究檢測了新生小鼠的糖脂代謝指標和胰島素抵抗指標，但未能發現孕期膽堿攝入不足或缺乏對新生小鼠血糖、胰島素、甘油三酯、總膽固醇和HOMO-IR有顯著影響。與上述研究存在不一致性，原因可能是體內糖脂代謝、胰島素抵抗的代謝過程、以及胎兒宮內生長發育過程非常復雜，特別是膽堿是重要的一碳代謝供體，參與了DNA甲基化修飾這一重要的表觀遺傳機制。表觀遺傳的對代謝的調控影響可能不會在子代出生時立刻顯現出來，可能會給子代打上遺傳印記，當出生后環境變化時出現相應的表型改變。研究者發現在高脂飲食誘導的孕期糖尿病大鼠模型中發現：給孕鼠補充膽堿可以預防孕中期胎兒體重的過度增長，其作用機理在于孕期膽堿補充可抑制胎盤mTOR信號通路，該信號通路可促進胎盤葡萄糖和脂肪的轉運[15]。在高脂飲食誘導的大鼠模型中發現補充甲基化供體飲食可減輕脂肪肝，修飾脂肪酸合成相關基因的甲基化水平，從而影響脂肪酸的合成[16]。有研究者在高脂飲食喂養導致肥胖的大鼠模型中發現，孕期補充膽堿顯著降低胎鼠肝臟脂肪酸合成相關基因Acc1, Fads, Elovl5, Srebp1c的microRNA富集，下調子鼠的肝臟脂肪酸合成[17]。

綜上，本研究成功構建了孕期膽堿缺乏影響子代糖脂代謝穩態的跨代動物模型，發現孕期膽堿缺乏小鼠孕期增重和新生子鼠的出生體重明顯降低，提示孕期膽堿營養缺乏可影響胎鼠宮內生長發育。但未發現孕期膽堿營養缺乏對子代糖脂代謝生化指標有顯著影響，下一步可以從表觀遺傳調控機制深入研究孕期膽堿營養不足對子代糖脂代謝穩態及健康的影響，