SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路在大鼠血管性認(rèn)知損傷中的作用及分子機(jī)制

陳罕，孫肖爽，李紅杰，韋紅偉，徐忠信

1 長(zhǎng)春市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，長(zhǎng)春130051；2 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

血管性認(rèn)知損傷是目前發(fā)展中國(guó)家認(rèn)知功能障礙的首要原因，但其確切的分子機(jī)制仍不清楚，而對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的研究一直是其中熱點(diǎn)。慢性腦缺血指各種原因引起的腦血流量長(zhǎng)期、慢性供血不足而導(dǎo)致的腦代謝障礙和功能衰退，被認(rèn)為是血管性癡呆、阿爾茨海默病的共同病理過程，可導(dǎo)致持久性進(jìn)展性認(rèn)知損傷，能夠較好的模擬血管性認(rèn)知損傷的病理生理過程［1-2］。沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（SIRT1）被發(fā)現(xiàn)可在腦缺氧、缺血相關(guān)疾病中通過多種機(jī)制減輕神經(jīng)損傷，并已成為多種疾病治療中的關(guān)鍵靶點(diǎn)［3］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ 共激活因子1（PGC-1α）是SIRT1 去乙酰化的直接靶點(diǎn)，其表達(dá)增加可以保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，過度產(chǎn)生的活性氧可激活海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的PGC-1α 信號(hào)通路，并上調(diào)其直接底物超氧化物歧化酶（SOD）的表達(dá)［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體保護(hù)作用減少高糖刺激誘導(dǎo)的腎臟足細(xì)胞的氧化損傷［6］，也可通過線粒體能量調(diào)節(jié)改善糖尿病性心肌病的心臟損傷［7］。石麗娜［8］發(fā)現(xiàn)，在胎鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪體外模型中，提高SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路表達(dá)后SOD表達(dá)增加、丙二醛（MDA）表達(dá)下降，提示SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激在血管性認(rèn)知損傷中發(fā)揮作用。2020年1月—12月，本研究通過建立慢性腦缺血大鼠模型，探討SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路在血管性認(rèn)知損傷中的作用，并分析該作用是否與氧化應(yīng)激有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 健康雄性2～3 月齡Wistar大鼠34 只，體質(zhì)量260～300 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0001。主要試劑：SIRT1 激活劑白藜蘆醇購自上海金穗生物科技有限公司，SIRT1 去乙酰化抑制劑EX-527 購自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology；兔抗鼠SIRT1 單克隆IgG抗體（#9475）購自美國(guó)Cell Signaling Technology；兔抗鼠PGC-1α多克隆IgG 抗體（sc-13067）購自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（ZB-2301）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物制品公司；SOD、MDA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。Morris 水迷宮由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，側(cè)腦室微量給藥系統(tǒng)購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，SIRT1、PGC-1α、β-actin 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 動(dòng)物分組與造模處理 將34 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、激活組、聯(lián)合組各7只及抑制組6只。采用改良版雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎法［9］制備慢性腦缺血大鼠模型。使用10% 水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，對(duì)大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端和近端進(jìn)行雙重結(jié)扎，同時(shí)剪斷大鼠尾末端；假手術(shù)組僅分離暴露大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈而不結(jié)扎。激活組、聯(lián)合組將白藜蘆醇溶于25% 二甲基亞砜?jī)?nèi)按25% 配制為10 mg/mL 溶液，以50 mg/（kg·d）連續(xù)腹腔注射；聯(lián)合組、抑制組將EX-527溶于25%二甲基亞砜按照1 μg/μL 經(jīng)微量注射器向腦室內(nèi)注射5 μL；假手術(shù)組及模型組大鼠均使用相同容積的25% 二甲基亞砜腹腔注射做對(duì)照；各組均連續(xù)給藥6周。

1.3 認(rèn)知功能觀察 采用Morris 水迷宮試驗(yàn)，包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。定位航行試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d，每日將各組大鼠面向池壁分別從4 個(gè)入水點(diǎn)放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。定位航行試驗(yàn)全部完成后，于當(dāng)日立即進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。在去除水下平臺(tái)后，從平臺(tái)對(duì)側(cè)象限將大鼠放入水池中，記錄在原平臺(tái)所在象限停留的時(shí)間。逃避潛伏期時(shí)間越短、目標(biāo)象限停留時(shí)間越長(zhǎng)，表示大鼠認(rèn)知功能越好。

1.4 海馬CA1區(qū)標(biāo)本獲取及處理 對(duì)完成認(rèn)知功能檢測(cè)后的大鼠進(jìn)行迅速斷頭取腦后立即放在冰盤上，迅速取出海馬。海馬取材起點(diǎn)為大鼠腦底部下丘腦處，即白色的視交叉處，于解剖顯微鏡下去除多余組織及血管，切除兩末端，將剩余海馬等份切為三段，垂直放置，在大彎端沿錐體線一分為二，上端透明部分為CA1區(qū)。對(duì)海馬標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，對(duì)所有組織標(biāo)本行從前向后冠狀切片，切片厚度均為4 μm。

1.5 SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)檢測(cè)

1.5.1 免疫組化 利用SP 法進(jìn)行免疫組化染色。使用二甲苯對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理后，將切片用3% H2O2孵育15 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS 漂洗3 次，每次5 min。使用檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，用5% 山羊血清處理10 min 以阻斷非特異性抗體的結(jié)合。切片滴加SIRT1、PGC-1α 一抗，以PBS 作為空白陰性對(duì)照，在濕盒中4 ℃過夜。用PBS 沖洗切片3 次，每次5 min，滴入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min。用PBS 沖洗切片3 次，每次5 min，將切片用鏈霉素親和素—過氧化物酶溶液37 ℃孵育30 min。用PBS 沖洗切片3次，每次5 min，向切片滴加DAB溶液顯色5～10 min。用自來水充分沖洗，進(jìn)行蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，干燥，加蓋玻片，等待鏡檢。每張切片利用HPLAS-1000 高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)于200 及400 倍鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野下SIRT1 和PGC-1α 陽性細(xì)胞總數(shù)占所有細(xì)胞總數(shù)的百分比率，以5 個(gè)視野的平均值作為最終判定指標(biāo)。

1.5.2 Western blotting 對(duì)大鼠進(jìn)行迅速斷頭取腦，立即將標(biāo)本放在冰盤上，迅速剝離海馬，立即投入-70 ℃液氮中保存提取海馬CA1區(qū)總蛋白。用0.2% 的TBS 稀釋SIRT1 一抗（1∶300），DAB 試劑盒顯色，凝膠成像及分析系統(tǒng)掃描，Quantity one v4.62定量分析。以目的蛋白與相應(yīng)β-actin 條帶凈光密度的比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

1.6 SIRT1、PGC-1α mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用qRTPCR 法。取保存于-70 ℃液氮中的海馬CA1區(qū)腦組織，采用TRIzol 法提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。SIRT1、PGC-1α 的退火溫度為58 ℃，β-actin 退火溫度為55 ℃。引物序列：SIRT1 上游引物5′-TGTGGTGAAGATCTATGGAGGC-3＇，下游引物5′-TGTACTTGCTGCAGACGTGGTA-3′；PGC-1α上游引物5′-TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT-3′，下游引物5′-GTCGCTACACCACTTCAATCC-3′；βactin 上游引物5′-CCAAGGCCAACCGCGAGAA?GATGAC-3′，下 游引 物5′-AGGGTACATGGTGGT?GCCGCCAGAC-3′。以β-actin 為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt計(jì)算SIRT1、PGC-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。取10% 的海馬CA1區(qū)腦組織勻漿，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，按SOD、MDA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以± s 表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組認(rèn)知功能比較 與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏期增長(zhǎng)、目標(biāo)象限停留時(shí)間減少。與模型組比較，激活組逃避潛伏期減少、目標(biāo)象限停留時(shí)間增長(zhǎng)，抑制組、聯(lián)合組逃避潛伏期增長(zhǎng)、目標(biāo)象限停留時(shí)間減少（P均<0.01）。見表1。

表1 各組認(rèn)知功能比較（s，±s）

表1 各組認(rèn)知功能比較（s，±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。

組別假手術(shù)組模型組激活組抑制組聯(lián)合組n 7 7 7 6 7逃避潛伏期第1天47.09 ± 2.18 50.76 ± 2.12 49.00 ± 2.80 50.87 ± 2.52 51.20 ± 3.48第2天22.97 ± 2.28 35.05 ± 2.73*27.64 ± 2.54#38.76 ± 3.78 39.85 ± 2.75#第3天16.51 ± 2.12 28.47 ± 3.33*23.33 ± 1.99#34.26 ± 2.29#33.62 ± 3.16#第4天12.14 ± 2.24 15.55 ± 2.34 13.22 ± 1.47 19.20 ± 2.04#21.21 ± 2.46#第5天11.89 ± 1.82 23.64 ± 3.66*16.88 ± 2.02#26.37 ± 2.00 28.23 ± 2.97#目標(biāo)象限停留時(shí)間51.44 ± 2.37 32.07 ± 2.17*38.85 ± 1.93#27.21 ± 1.86#28.86 ± 1.80#

2.2 各組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)減少。與模型組比較，激活組SIRT1、PGC-1α 蛋白表達(dá)增加；抑制組PGC-1α 蛋白表達(dá)減少；聯(lián)合組SIRT1 蛋白表達(dá)增加、PGC-1α 蛋白表達(dá)減少（P均<0.05）；抑制組SIRT1蛋白表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組SIRT1、PGC-1α蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組激活組抑制組聯(lián)合組n 7 7 7 6 7 SIRT1免疫組化0.39 ± 0.06 0.13 ± 0.05*0.22 ± 0.04#0.10 ± 0.05 0.22 ± 0.02#Western blotting 1.33 ± 0.05 0.82 ± 0.03*1.10 ± 0.06#0.74 ± 0.06 1.11 ± 0.05#PGC-1α免疫組化0.87 ± 0.04 0.58 ± 0.03*0.72 ± 0.07#0.46 ± 0.04#0.45 ± 0.04#Western blotting 1.68 ± 0.11 0.99 ± 0.10*1.39 ± 0.09#0.46 ± 0.08#0.55 ± 0.05#

2.3 各組SIRT1、PGC-1α mRNA 表達(dá)比較 各組SIRT1、PGC-1α mRNA 表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組SIRT1、PGC-1α mRNA表達(dá)比較（±s）

注：各組間比較，P>0.05。

組別假手術(shù)組模型組激活組聯(lián)合組抑制組n 7 7 7 7 6 SIRT1 1.07 ± 0.14 1.02 ± 0.12 1.04 ± 0.11 1.07 ± 0.13 1.06 ± 0.14 PGC-1α 0.98 ± 0.10 0.96 ± 0.09 0.94 ± 0.10 0.95 ± 0.09 1.01 ± 0.71

2.4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA 水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組SOD 水平降低、MDA 水平升高。與模型組比較，激活組SOD 水平升高、MDA 水平降低，抑制組SOD 水平降低、MDA 水平升高，聯(lián)合組MDA 水平升高（P均<0.05）；聯(lián)合組SOD 水平與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平比較（±s）

表4 各組氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

組別假手術(shù)組模型組激活組抑制組聯(lián)合組n 7 7 7 6 7 SOD 98.15 ± 4.43 81.98 ± 5.79*91.71 ± 4.78#69.24 ± 2.83#78.19 ± 5.30 MDA 10.60 ± 2.61 18.11 ± 4.21*11.35 ± 2.35#35.26 ± 7.03#27.43 ± 2.63#

3 討論

目前認(rèn)為，血管性癡呆是惟一可以防治的癡呆，但其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚［10］。一些已經(jīng)應(yīng)用于臨床的治療藥物對(duì)于血管性癡呆的臨床癥狀改善效果不盡人意，這種情況也一直引導(dǎo)和激勵(lì)著眾多研究者對(duì)其展開更廣泛深入的研究。慢性腦缺血能夠?qū)е掠谰眯匝苄哉J(rèn)知損傷，但目前慢性腦缺血與血管性認(rèn)知損傷中精確的分子機(jī)制尚未完全確定，對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步研究可能為血管性癡呆的治療提供新的干預(yù)手段。

慢性腦缺血引起的認(rèn)知損傷病理生理機(jī)制復(fù)雜，而氧化應(yīng)激可被認(rèn)為是其中關(guān)鍵因素，并可作為治療血管性認(rèn)知損傷的潛在靶點(diǎn)［11-12］。慢性腦缺血能夠產(chǎn)生一種嚴(yán)重的永久性缺血、缺氧狀態(tài)，而這種狀態(tài)同時(shí)足以維持持續(xù)的氧化應(yīng)激，該機(jī)制可能是導(dǎo)致持續(xù)和進(jìn)行性神經(jīng)元損傷的原因。本研究結(jié)果顯示，慢性腦缺血時(shí)大鼠海馬CA1區(qū)氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD 水平下降、MDA 水平升高，提示腦內(nèi)抗氧化系統(tǒng)能力下降，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化應(yīng)激可能參與了認(rèn)知損傷的發(fā)生發(fā)展。SIRT1 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以在多種疾病狀態(tài)下調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)，并可調(diào)控包括PGC-1α 在內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路［13］。研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的SIRT1 可以調(diào)節(jié)病理?xiàng)l件下細(xì)胞氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。SIRT1相關(guān)通路的活性可以通過其天然激活劑白藜蘆醇來增強(qiáng)，也可以通過SIRT1 去乙酰化抑制劑EX-527 來減弱［12］。我們的研究顯示，慢性腦缺血時(shí)使用白藜蘆醇和EX-527對(duì)SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，可伴隨著SOD、MDA 水平的改變，提示SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路與慢性腦缺血時(shí)大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)。

目前，關(guān)于SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路與癡呆的研究較少。王承展［14］發(fā)現(xiàn)，SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路在阿爾茨海默病模型中可以發(fā)揮認(rèn)知改善作用。周羅可等［15］發(fā)現(xiàn)，SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路可以減輕血管性癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。我們的研究顯示，SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路通過氧化應(yīng)激參與了血管性認(rèn)知損傷。 慢性腦缺血時(shí)，大鼠海馬CA1區(qū)SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路蛋白水平下降，提示腦缺血、缺氧后其活性受到抑制；通過白藜蘆醇上調(diào)SIRT1/PGC-1α 通路表達(dá)后，大鼠學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，伴隨SOD 水平上升和MDA 表達(dá)下降；EX-527 則可抑制SIRT1 對(duì)PGC-1α 蛋白增強(qiáng)表達(dá)作用，以及SOD 和MDA 水平的變化。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了慢性腦缺血時(shí)SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路活性受到抑制，而增強(qiáng)其活性可通過對(duì)抗腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)改善大鼠的血管性認(rèn)知損傷。本研究qRT-PCR 結(jié)果顯示，SIRT1 和PGC-1α 的mRNA 水平各組間比較差異不明顯，提示慢性腦缺血后，SIRT1/PGC-1α 通路活性受到抑制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，這與SCHIRMER 等［16］在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致。而SHI 等［17］報(bào)道在氧糖剝奪所致氧化應(yīng)激體外模型的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元內(nèi)，SIRT1 和PGC-1α 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均受到抑制，推測(cè)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因可能是SHI 等的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅举|(zhì)上是急性缺血缺氧狀態(tài)下的體外細(xì)胞應(yīng)激模型，而我們的實(shí)驗(yàn)則是慢性缺血的體內(nèi)模型，可能SIRT1 和PGC-1α 的轉(zhuǎn)錄水平受到了其他因素的調(diào)節(jié)和代償。

綜上所述，SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路在慢性腦缺血時(shí)活性受到抑制，使用白藜蘆醇上調(diào)SIRT1/PGC-1α 信號(hào)通路表達(dá)后可以改善大鼠的血管性認(rèn)知損傷，這可能與腦內(nèi)增強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。