楮果總黃酮體外抗氧化及對CCl4致腦損傷小鼠的保護作用

高志麗，王瑞雯，崔嘉紋，白亞楠，史海龍，李 洋

（華北理工大學藥學院，河北唐山 063000）

許多污染物如藥物、殺蟲劑、煙草煙霧、有機溶劑和有毒物質等都會引起氧化應激[1]，使體內活性氧自由基的生成和細胞抗氧化防御體系之間失衡，危害機體健康。由于大腦代謝率很高且主要為有氧代謝，會產生大量活性氧自由基，更容易發生氧化應激[2]，對腦組織造成氧化損傷。多種腦部疾病如心腦血管疾病、阿爾茲海默癥等的發生發展機制，都涉及到氧化應激損傷[3]。抗氧化劑能抑制自由基的生成，改善機體抗氧化防御體系，延緩慢性疾病的發展[4]。因此，研究安全、有效、無毒、無副作用、能預防或減輕氧化應激的天然抗氧化劑具有重要意義。國內外研究表明，黃酮類化合物在體內外具有清除活性氧自由基、抑制脂質過氧化、增強體內抗氧化的能力[5]，是天然抗氧化劑研究的熱點。

楮果是桑科構屬植物構樹（Broussonetia papyriferaL.）的成熟果實，無毒、可食用，在我國分布非常廣泛，資源豐富[6]，在民間已有上千年的歷史，是我國傳統民間草藥和保健食品。楮果中含有礦物元素、多糖、維生素、脂肪油、生物堿、色素等多種化學成分[7]，其中色素呈橙紅色，色澤鮮艷，穩定性較好，經初步分析屬于黃酮醇類黃酮化合物[8]。楮果在改善記憶[9]、保護神經元[10]、抗氧化[11]等方面表現出良好的活性，但目前國內外對楮果總黃酮的研究還集中于提取、含量測定等方面，關于其抗氧化活性、防治氧化應激的研究報道較少，其食用和藥用價值尚未得到開發利用。

動物四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）中毒是一種模擬氧化應激的實驗模型，在肝臟、腎臟、大腦和血液等組織中都能引起自由基的產生，造成氧化應激損傷[12?13]。本研究將楮果總黃酮的體外抗脂質過氧化實驗與CCl4誘導小鼠腦組織氧化損傷實驗相結合，評價其體內外抗氧化能力，為楮果總黃酮在功能性食品、抗氧化保健品和化妝品方面的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級昆明雄性小鼠60 只 體重（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，飼養于華北理工大學實驗動物中心，飼養環境12 h 黑暗的光照周期，溫度在21～23 ℃和濕度在50%～60%，給予喂食認證的飲食和純凈水；楮果 采摘于唐山，經華北理工大學藥學院劉占軍教授鑒定為桑科構樹屬植物構樹（Broussonetia papyriferaL.）的果實；肝素鈉 美國biosharp 公司；過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2） 天津凱通化學試劑有限公司；L-抗壞血酸、硫代巴比妥酸 國藥集團化學試劑有限公司；三氯乙酸 北京邁瑞達科技有限公司；蘆丁（純度>95%） 中國藥品生物制品檢定所；水飛薊素 美國Sigma 公司；CCl4分析純，天津市北方天醫化學試劑廠；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅染色液 珠海貝索生物技術有限公司。

Lambda 35 紫外可見分光光度計 美國Perkin-Elmer 公司；VCX 130 超聲勻漿器 美國Sonics &Materials 公司；ST 16R 冷凍離心機 美國Thermo Fisher 公司；ELX800 酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；BX53F 顯微鏡 日本OLYMPUS 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 楮果總黃酮的制備與含量測定 楮果洗凈晾干，加入80%乙醇（料液比1:10 g/mL）在40 ℃、640 W超聲下提取30 min，反復提取3 次，合并濾液，減壓濃縮，得楮果總黃酮粗提液[14]；稱取活化的D-101 大孔樹脂3 g（濕重），加楮果總黃酮粗提液50 mL，置于轉速140 r/min、25 ℃恒溫振蕩器上，振蕩吸附12 h后，用去離子水清洗吸附了黃酮的D-101 大孔樹脂，然后加入50 mL 80%乙醇溶液，置于恒溫振蕩器上解吸24 h，抽濾，保存濾液（解吸液）[15]。解吸液減壓濃縮后凍干，得楮果總黃酮粉末。參照《中國藥典》2015 年版第一部“山楂葉”項下總黃酮的含量測定方法，以蘆丁標準品為對照，用NaNO2?Al（NO3）3?NaOH 分光光度法繪制回歸曲線，得到回歸方程為：y=11.152x+0.0001，相關系數R2=0.999。按以上方法測得楮果總黃酮純度達63.6%。

1.2.2 楮果總黃酮體外抗氧化能力的測定

1.2.2.1 對紅細胞溶血抑制率的測定 昆明種小鼠禁食過夜，摘眼球采血，加入肝素鈉抗凝。血樣中加10 倍磷酸鹽緩沖液（pH7.4），2000 r/min 離心5 min，沉淀物按上述方法離心洗滌3 次，制備為0.5%的紅細胞懸液，于4 ℃保存（制備6 h 內使用）。

取1 mL 紅細胞懸液，加0.1 mL 不同濃度的楮果總黃酮溶液（對照組加去離子水0.1 mL）和0.1 mL H2O2（100 mmol/L），37 ℃恒溫水浴1 h，加入4 mL磷酸鹽緩沖液，2000 r/min 離心5 min，415 nm 測吸光度，以抗壞血酸為陽性對照[16]。紅細胞溶血抑制率計算公式如下：

式中：A415（對照）為空白組吸光度；A415（樣品）為樣品組吸光度。

1.2.2.2 對肝、腦組織勻漿的脂質過氧化抑制率的測定 取新鮮小鼠肝、腦組織，用預冷磷酸鹽緩沖液沖洗血漬，擦干，稱重。按料液比1:9的比例加磷酸鹽緩沖液，將肝、腦組織于冰上剪碎、研磨，制成10%組織勻漿，3500 r/min 離心15 min，上清液4 ℃保存備用（用時稀釋）。

取10%肝勻漿和2%腦勻漿各1 mL，分別加入0.1 mL 不同濃度楮果總黃酮溶液（對照組加去離子水），混勻，37 ℃水浴30 min，然后加0.1 mL H2O2（100 mmol/L），再水浴30 min，最后加入20%三氯乙酸和0.67%硫代巴比妥酸各1 mL，混勻后置于95 ℃水浴15 min，冷卻后以5000 r/min 離心10 min，在532 nm 處測定上清液吸光度，用抗壞血酸作為陽性對照[17]。脂質過氧化抑制率計算公式如下：

式中：A532（對照）空白組吸光度；A532（樣品）樣品組吸光度。

1.2.2.3 線粒體腫脹度的測定 在4 ℃條件下，將10%肝勻漿1000 r/min 離心20 min，再將上清液10000 r/min 離心20 min，所得沉淀再加10 倍體積磷酸鹽緩沖液10000 r/min 離心20 min，最后用冰磷酸鹽緩沖液重懸制成懸液[18]。考馬斯亮藍染色法測定其蛋白濃度，調整為0.5 mg/mL 線粒體懸液，4 ℃保存。

取線粒體懸液2 mL 加不同濃度的楮果總黃酮溶液0.2 mL，再加FeSO4溶液（0.5 mmol/L）和抗壞血酸溶液（0.5 mmol/L）各0.2 mL，混勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋，每隔5 min 在520 nm 測吸光度[18]。空白組用等體積磷酸鹽緩沖液代替黃酮溶液、FeSO4溶液和抗壞血酸溶液，模型組用等體積磷酸鹽緩沖液代替黃酮溶液，用蘆丁作為陽性對照。

1.2.2.4 總抗氧化能力的測定 依次向試管中加H2SO4（3.0 mol/L）、Na3PO4（0.14 mol/L）和鉬酸銨（0.02 mol/L）各1.0 mL，然后加入1.0 mL 不同濃度的楮果總黃酮溶液（空白組加等體積去離子水），再加入1.0 mL去離子水，混勻后95 ℃水浴加熱90 min，695 nm 測吸光度[19]。用抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.3 楮果總黃酮對CCl4致小鼠腦損傷的防護作用

1.2.3.1 小鼠腦損傷模型的建立 將60 只昆明種小鼠隨機分為6 組（每組10 只）：空白組、模型組、陽性對照組（水飛薊素，0.2 g/kg）、楮果總黃酮低劑量組（0.15 g/kg）、楮果總黃酮中劑量組（0.3 g/kg）、楮果總黃酮高劑量組（0.6 g/kg），灌胃給藥（楮果總黃酮低、中、高劑量組灌胃劑量設置依據預實驗結果），1次/d，空白組和模型組每天灌胃10 mL/kg 等體積羧甲基纖維素（CMC）。除空白組外，其余各組隔天腹腔注射1:1 CCl4花生油溶液2 mL/kg，空白組給予同體積花生油，持續14 d[4,20]。末次給藥后，禁食24 h處死小鼠，迅速取出腦組織。將右腦固定在4%多聚甲醛中以制備石蠟切片，將其余部分立即儲存在?80 ℃用于其他測定。

1.2.3.2 測定氧化應激指標 取腦組織稱重，按重量體積比（1:9）加入生理鹽水，并于冰上剪碎，研磨制備為10%腦組織勻漿。3500 r/min 離心15 min，取適量上清液用于檢測氧化應激指標MDA、GSH 含量及SOD、GSH-PX、CAT 活性，具體步驟按照相應試劑盒說明書進行。

1.2.3.3 組織病理學分析 取空白組、模型組、水飛薊素組和楮果總黃酮各劑量組小鼠腦組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟透明，HE 染色，中性樹膠封固。光鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化能力

2.1.1 楮果總黃酮對紅細胞的保護作用 紅細胞具有很典型的生物體細胞膜結構，常用于分析和篩選天然抗氧化劑。在H2O2誘導下可以產生活性很強的·OH，誘發多不飽和脂肪酸氧化，破壞生物膜的結構和功能，從而造成紅細胞溶血[16]。由圖1 可見，在實驗濃度0.1～3.2 mg/mL 之間，楮果總黃酮與抗壞血酸都表現出抑制小鼠紅細胞溶血活性，且抑制活性隨濃度的增加而增強。楮果總黃酮和抗壞血酸抑制紅細胞溶血的IC50值分別為1.14 mg/mL 和0.43 mg/mL，雖然楮果總黃酮的IC50大于抗壞血酸，但當濃度為3.2 mg/mL 時，其對紅細胞溶血的抑制作用與抗壞血酸已無明顯差異，說明楮果總黃酮對紅細胞溶血有較強的抑制作用。

圖1 楮果總黃酮對紅細胞溶血的抑制能力Fig.1 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on erythrocyte hemolysis

2.1.2 楮果總黃酮對肝、腦勻漿脂質過氧化抑制活性 脂質過氧化是多不飽和脂肪酸在細胞膜上的氧化過程，是氧自由基引起的主要有害變化之一[21]。不飽和脂肪酸的氧化分解會導致脂質過氧化鏈式反應，生成丙二醛等小分子產物容易引起細胞形態和功能的改變[18]。由圖2 可見，在實驗濃度范圍（0.4～12.8 mg/mL）內，楮果總黃酮對肝臟脂質過氧化有一定的抑制作用，抑制率隨濃度的增加而增加；其IC50值為1.19 mg/mL，抗壞血酸IC50值為1.06 mg/mL。當濃度大于6.4 mg/mL 時，楮果總黃酮對肝脂質過氧化的抑制率達90%以上，大于抗壞血酸對肝脂質過氧化的抑制率，說明楮果總黃酮對肝組織脂質過氧化有較強的抑制作用。

圖2 楮果總黃酮對肝勻漿脂質過氧化的抑制能力Fig.2 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on lipid peroxidation of liver homogenate

由圖3 可見，在實驗濃度范圍內，楮果總黃酮對腦勻漿脂質過氧化現象的抑制作用迅速增長，且呈現劑量依賴關系；其IC50值為0.87 mg/mL，抗壞血酸IC50值為7.88 mg/mL，說明楮果總黃酮對腦組織勻漿脂質過氧化的抑制作用遠高于抗壞血酸。

圖3 楮果總黃酮對腦勻漿脂質過氧化的抑制能力Fig.3 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on lipid peroxidation of brain homogenate

2.1.3 楮果總黃酮對線粒體腫脹度的抑制作用 在自由基存在下，線粒體膜極容易受到自由基的攻擊，導致脂質過氧化，致使膜結構被破壞，線粒體通透性發生改變，從而引發線粒體腫脹[22]。由圖4 可見，模型組的吸光度隨著時間的增長呈明顯下降趨勢，楮果總黃酮2、4 mg/mL 組和蘆丁實驗組吸光度下降幅度明顯降低，楮果總黃酮濃度越大吸光度下降幅度越小，同濃度下楮果總黃酮較陽性對照蘆丁組的吸光度下降幅度小，表明楮果總黃酮對線粒體腫脹有抑制作用，且對線粒體的保護作用強于蘆丁。

圖4 楮果總黃酮對線粒體腫脹的抑制能力Fig.4 Inhibitory effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on mitochondrial swelling

2.1.4 楮果總黃酮的總抗氧化力 用磷鉬酸鹽絡合物法測樣品的總抗氧化力，該方法的原理是鉬在硫酸和磷酸的作用下發生還原反應，產物為綠色，在695 nm 處有較強的吸收峰[23]。而抗氧化劑會與鉬競爭發生還原反應，其抗氧化的能力可由生成鉬藍的量間接反映，吸光度越大代表總抗氧化能力也越大。由圖5 可知，隨著楮果總黃酮濃度的增加，總抗氧化能力逐漸增強，抗氧化能力與濃度之間存在明顯的量效關系，說明楮果總黃酮具有一定的抗氧化能力。

圖5 楮果總黃酮的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of total flavonoids from paper mulberry fruits

2.2 楮果總黃酮對CCl4 致腦氧化損傷小鼠的保護作用

2.2.1 楮果總黃酮對小鼠腦組織MDA 含量的影響MDA 是細胞內脂質過氧化自由基的分解產物，是脂質過氧化和氧化應激的重要生物標志物之一，產生過量會破壞生物膜的結構和功能[24]。MDA 含量可反映組織細胞脂質過氧化的速率或強度。如圖6 所示，與空白組相比，模型組MDA 含量極顯著增加（P<0.01），表明CCl4誘導的小鼠腦氧化損傷模型成功建立。與模型組相比，連續灌胃楮果總黃酮后，楮果總黃酮中、高劑量組小鼠腦組織MDA 含量極顯著降低（P<0.01），降低程度與灌胃劑量成明顯的量效關系，可見楮果總黃酮能降低小鼠腦組織脂質過氧化反應，防護腦組織氧化損傷。

圖6 楮果總黃酮對小鼠腦組織MDA的影響（,n=10）Fig.6 Effects of total flavonoids from paper mulberry fruits on MDA content in brain tissue of mice (,n=10)

2.2.2 楮果總黃酮對小鼠腦組織GSH 含量的影響GSH 是一種重要的非酶促抗氧化劑，在細胞內和細胞外都能對抗外來生物和中和活性氧，因此，體內GSH 水平被認為是其抗氧化能力的重要指標[20,25]。如圖7 所示，模型組小鼠腦組織GSH 含量較空白組顯著降低（P<0.01），表明CCl4能破壞機體抗氧化防御機制。連續灌胃楮果總黃酮后，各劑量組小鼠腦組織GSH 含量顯著提高（P<0.01），表明楮果總黃酮能顯著增強小鼠腦組織的抗氧化能力。同時，楮果總黃酮高劑量組的GSH 含量與空白組相比已無顯著性差異（P>0.05），可見高劑量的楮果總黃酮對組織抗氧化能力的恢復作用效果出色。

圖7 楮果總黃酮對小鼠腦組織GSH 含量的影響（,n=10）Fig.7 Effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on GSH content in brain tissue of mice (,n=10)

2.2.3 楮果總黃酮對小鼠腦組織中SOD、GSH-PX和CAT 活性的影響 SOD、GSH-PX 和CAT 等是體內重要的抗氧化酶，在清除活性氧和防止活性氧形成的過程中起著至關重要的作用。SOD 是機體抵抗活性氧的一種防御機制，在氧化與抗氧化平衡中起著重要的作用，是過氧陰離子自由基的清除劑，能抑制自由基誘導的脂質過氧化，保護細胞免受氧化應激損傷[26]。GSH-PX 部分位于細胞膜內，是抗脂質過氧化作用的酶保護系統之一[27?28]。GSH-PX 和CAT 分解H2O2，同時最大限度減少羥基自由基的潛在危害[2]。如圖8 所示，模型組小鼠腦組織SOD、GSH-PX 和CAT 酶活性較空白組均明顯降低，且差異具有統計學意義（P<0.01），表明給予小鼠CCl4后，機體出現氧化應激反應。與模型組相比，楮果總黃酮各組小鼠腦組織中SOD 和GSH-PX 活性均極顯著升高（P<0.01），楮果總黃酮中、高劑量組小鼠腦組織CAT 活性顯著升高（P<0.05 或P<0.01），且呈良好的劑量依賴關系，同時，楮果總黃酮高劑量組與空白組SOD 和GSHPX 活性相比已無顯著差異（P>0.05），可見楮果總黃酮對CCl4誘導的小鼠腦組織氧化應激具有較明顯的抑制作用；以上結果表明楮果總黃酮可通過提高CCl4致腦損傷小鼠腦組織中SOD、GSH-PX 和CAT 酶活性，發揮防護腦組織氧化應激損傷的作用，且劑量越高保護效果越好。

圖8 楮果總黃酮對小鼠腦組織中SOD、GSH-PX 和CAT 活性的影響（,n=10）Fig.8 Effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on SOD,GSH-PX,CAT activity in brain tissue of mice (,n=10)

2.2.4 病理組織學觀察 如圖9 可見，空白組腦組織海馬區組織學表現正常，神經細胞數目多，排列緊密，均勻整齊，胞核全染；而模型組神經細胞結構疏松，數量減少，排列紊亂，核輪廓不規則，核異色、固縮、核仁消失、胞漿周圍暈染、細胞間距大，說明腦組織發生了嚴重的氧化應激損傷。楮果總黃酮干預后，腦組織海馬區神經細胞有不同程度的恢復。低劑量組海馬區細胞疏松，部分神經細胞不飽滿，神經細胞胞漿和細胞核界限不清；中劑量組海馬區病理性形態學改變有明顯改善；高劑量組海馬區細胞較為致密，細胞數量和形態基本恢復正常。由此可見，楮果總黃酮對CCl4致小鼠腦氧化損傷具有顯著的防護作用，防護作用與楮果總黃酮濃度呈明顯的量效關系。

圖9 楮果總黃酮對小鼠腦組織海馬區病理形態學的影響（HE，400×）Fig.9 Effect of total flavonoids from paper mulberry fruits on pathomorphological of hippocampus in mice brain tissue (HE，400×)

3 結論

體外實驗數據表明，楮果總黃酮對生物膜實驗體系中紅細胞溶血和肝組織脂質過氧化的抑制作用達到一定濃度時，大于陽性對照；而其對于腦組織脂質過氧化和線粒體腫脹的抑制作用均大于陽性對照，且抑制能力與濃度呈顯著的量效關系，總抗氧化能力也很強。由此證明，楮果總黃酮具有較強的體外抗氧化能力。體內實驗結果表明，低劑量楮果總黃酮對小鼠腦組織SOD、GSH 和GSH-PX 水平均有改善作用，對MDA 含量和CAT 活性無明顯改善作用；而中、高劑量楮果總黃酮均能顯著降低CCl4致氧化損傷小鼠腦組織中過氧化物質MDA 含量，升高抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT 活性，增加GSH 含量，提高機體防御能力，并修復腦組織海馬區病理學變化。由此可見，楮果總黃酮對小鼠腦組織氧化損傷的保護作用是通過降低MDA 水平，升高GSH 含量，同時提升SOD、GSH-PX 和CAT 活性來實現的。有研究表明，黃酮類化合物槲皮苷通過降低MDA 水平并將SOD、GSH-PX 和CAT 酶的活性恢復到接近正常水平來發揮其對CCl4誘導小鼠腦損傷的保護作用[20]。這與本研究結果相一致。

綜上所述，楮果總黃酮具有良好的體內外抗氧化活性，有助于保護機體免受氧化應激產生的有害影響，可作為新型天然抗氧化劑，對功能性食品、營養保健品方面的研究和開發具有巨大的經濟價值。