miR-1277-5p通過調(diào)控PHF8對卵巢癌SKOV-3細胞增殖和凋亡的影響

鮑群麗 萬淑瓊 黃耿 汪宏良 柯俊 尚小玲

1鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院檢驗科 435000；2鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院婦科 435000；3鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院泌尿外科 435000

卵巢癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，70%的卵巢癌患者確認時已處于晚期，5年生存率較低［1-2］。卵巢癌的高復發(fā)率和增殖是導致卵巢癌預后差的主要原因［3］。微小RNA（miRNA，miR）在卵巢癌細胞增殖中的作用及相關研究引起學者廣泛的重視［4］。miRNA在卵巢癌組織中的表達水平與腫瘤細胞的惡性生物學行為存在顯著相關性［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1277-5p是一種由24個核苷酸組成的miRNA，其在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用［7］。miR-1277-5p對卵巢癌細胞增殖和凋亡的作用并不清楚。本研究通過構建miR-1277-5p過表達細胞系，觀察miR-1277-5p表達變化對卵巢癌細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 卵巢癌細胞SKOV-3購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；McCoy's 5A培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒購于大連寶生物公司；結晶紫購于美國Sigma公司；對照模擬物、miR-1277-5p模擬物購于上海吉瑪制藥技術有限公司；Lipofectamine 3000購于美國Life Technologies公司；細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；一抗和辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（IgG）二抗購于美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染 選擇含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)SKOV-3細胞，培養(yǎng)條件選擇37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。按比例將稀釋的對照模擬物、miR-1277-5p模擬物與Lipofectamine 3000混合，室溫孵育15 min形成復合物，NC組為對數(shù)生長期SKOV-3細胞轉染對照模擬物，miR-1277-5p組為對數(shù)生長期SKOV-3細胞轉染miR-1277-5p模擬物。

1.3 qRT-PCR檢測miR-1277-5p、PHD鋅指蛋白8（PHF8）mRNA表達 TRIzol試劑盒提取NC組和miR-1277-5p組細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書擴增，引物序列如下，PHF8引物正向序列：5’-GTGCCGGTGTATTGCCTCT-3’，反 向 序 列：5’-CAACACAACTGCCATGAAACC-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（GAPDH）引 物 正 向 序 列 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反 向 序 列：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；miR-1277-5p引物正向序列：5’-TACGTAGATATATATGTATTTT-3’，反向序列：5’-GGTGCCAAGGCTTGCATTCA-3’；RNU6引物正向序列：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，反向序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。以GAPDH和RNU6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析所得qRT-PCR結果。

1.4 平板集落形成實驗檢測SKOV-3細胞增殖 使用胰酶消化各組SKOV-3細胞，制成單細胞懸液，每孔1×103個接種至6孔板，培養(yǎng)10 d至肉眼可見集落，使用甲醇溶液固定20 min、0.1%結晶紫染色20 min，拍照并計數(shù)集落數(shù)量。

1.5 流式細胞術檢測SKOV-3細胞凋亡 使用胰酶消化各組SKOV-3細胞，使用1×Binding Buffer緩沖液洗滌1次，加入100μl異硫氰酸熒光素（FITC）試劑到細胞管，加入5μl PI試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)15 min。加入400μl 1×Binding Buffer緩沖液到細胞管，1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測每組細胞凋亡率。

1.6 蛋白質印跡（Western blot）檢測PHF8蛋白的表達 使用細胞裂解液提取各組SKOV-3細胞總蛋白，電泳分離蛋白并轉膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，使用5%脫脂牛奶進行封閉，加入稀釋的一抗4℃孵育過夜，加入IgG二抗室溫孵育2 h，使用電化學發(fā)光（ECL）顯影液進行顯影。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較應用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組SKOV-3細胞中miR-1277-5p的表達 NC組和miR-1277-5p組SKOV-3細胞中miR-1277-5p的表達分別為（1.22±0.42）和（13.22±1.42），miR-1277-5p組相比NC組上調(diào)了10.84倍（t=8.12，P＜0.01）。見圖1。

圖1 NC組和miR-1277-5p組SKOV-3細胞中miR-1277-5p的表達

2.2 miR-1277-5p對SKOV-3細胞增殖的影響 細胞平板集落形成試驗顯示（圖2），NC組和miR-1277-5p組集落形成數(shù)分別為（150.70±18.69）個和（67.97±14.82）個，NC組集落的數(shù)量高于miR-1277-5p組，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.93，P＜0.01），表明miR-1277-5p過表達抑制SKOV-3細胞增殖。

圖2 miR-1277-5p對SKOV-3細胞增殖的影響

2.3 miR-1277-5p對SKOV-3細胞凋亡的影響 流式細胞術顯示（圖3），NC組和miR-1277-5p組細胞凋亡率分別為（6.17±1.63）%和（26.12±2.99）%，NC組凋亡率少于miR-1277-5p組，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.86，P＜0.01），表明miR-1277-5p過表達促進SKOV-3細胞凋亡。

圖3 miR-1277-5p對SKOV-3細胞凋亡的影響

2.4 miR-1277-5p對PHF8 mRNA表達的影響 如圖4，本研究通過RNAhybrid預測miR-1277-5p的靶基因可能是PHF8。NC組和miR-1277-5p組SKOV-3細胞中PHF8mRNA的表 達 分 別為（2.01±0.41）和（0.20±0.06），表明miR-1277-5p可 抑 制PHF8 mRNA的 表 達（t=4.32，P＜0.01）。

圖4 miR-1277-5p與PHF8 mRNA的互補結合位點

2.5 miR-1277-5p對PHF8蛋白表達的影響Western blot結果表明（圖5），與NC組相比，miR-1277-5p組SKOV-3細胞PHF8蛋白減少，周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）表達降低，抗凋亡相關蛋白Bcl-2表達降低。

圖5 高表達miR-1277-5p對SKOV-3細胞PHF8蛋白表達的影響

3 討 論

研究顯示，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展受miRNA的調(diào)控［3，8］。miRNA如miR-485-5p［9］、miR-665［10］在卵巢癌中高表達，可促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。miRNA如miR-584［11］、miR-199b-3p［12］在卵巢癌中低表達，抑制卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。通過研究miRNA對卵巢癌細胞惡性生物學行為的影響來尋找腫瘤治療靶點，已成為當前卵巢癌治療領域研究的熱點。Wei等［7］研究顯示，miR-1277-5p在胃癌組織中低表達，上調(diào)miR-1277-5p可抑制胃癌細胞的增殖和轉移，miR-1277-5p在胃癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用。miR-1277-5p在卵巢癌細胞中的作用并不清楚。本研究表明，過表達miR-1277-5p后，卵巢癌SKOV-3細胞增殖降低，細胞凋亡增多，可見miR-1277-5p在卵巢癌細胞中表現(xiàn)為抑癌基因的作用。

miRNA主要通過結合靶基因mRNA的非翻譯區(qū)，抑制mRNA的翻譯或者直接誘導其降解，從而干擾靶基因蛋白的表達［13-14］。本研究通過RNAhybrid預測miR-1277-5p的靶基因可能是PHF8。PHF8蛋白是一種組蛋白去甲基化酶，通過去甲基化修飾組蛋白的賴氨酸殘基，調(diào)控基因的表達［15］。PHF8在前列腺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤中高表達，參與調(diào)控腫瘤細胞的分化、增殖、凋亡等生物學行為，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［16］。本研究顯示，增強miR-1277-5p表達后SKOV-3細胞中PHF8基因表達明顯降低，提示miR-1277-5p可靶向抑制PHF8的表達。miR-1277-5p抑制PHF8表達后，SKOV-3細胞中增殖相關蛋白CDK2表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，表明SKOV-3細胞的增殖降低、凋亡增加。

綜上所述，增加miR-1277-5p表達可降低卵巢癌SKOV-3細胞的增殖、誘導細胞凋亡，其可能是通過抑制PHF8基因表達實現(xiàn)，miR-1277-5p在卵巢癌的靶向治療中可能具有一定的應用前景。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。