氯普魯卡因通過調控長鏈非編碼RNA TTN?AS1表達對膠質瘤細胞增殖和轉移的影響

彭湃，楊軍，邱勇

膠質瘤是常見的原發性腦腫瘤，其呈浸潤性生長，易轉移，其治療方式仍以手術切除為主，同時輔以放、化療，然而目前膠質瘤的治療效果還不盡如人意。研究表明很多腫瘤病人在術后腫瘤易復發和轉移，影響病人生存率，而麻醉藥可影響腫瘤的微轉移。氯普魯卡因（chloroprocaine，CP）是一類新型的酯類高效局麻藥，其起效快、效果確切、不良反應小、麻醉效應強，麻醉后恢復快的優點。研究報道CP可抑制人宮頸癌細胞HeLa和CaSki增殖，誘導抑癌基因上皮型鈣黏蛋白1（epithelial cadherin 1，CDH1）、結腸腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyp?osis coli，APC）及P16啟動子去甲基化。CP可抑制乳腺癌MDA-MB-231 細胞活力和遷移。Titin 反義RNA 1（titin antisense RNA 1，TTN-AS1）在肺腺癌的組織和細胞中上調，并與較差的總體生存率相關，TTN-AS1 可促進肺癌細胞的惡性生物學行為。TTN-AS1 在食管鱗狀細胞癌組織和細胞系中高表達，并促進細胞增殖和轉移。TTN-AS1 通過miR-573/E2F 轉錄因子3（E2F3）促進宮頸癌中的細胞生長和轉移。以上研究表明CP 具有一定的抑癌作用，TTN-AS1也與癌癥的增殖、轉移相關，然而CP和長鏈非編碼RNA（lncRNA）TTN-AS1 對膠質瘤細胞增殖和轉移的影響還尚未可知。因此，本實驗自2019 年6—11 月研究氯普魯卡是否通過調控TTNAS1表達影響膠質瘤細胞的增殖和轉移。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

膠質瘤細胞株U251 購自上海冠導生物工程有限公司；RPMI-1640培養基、胎牛血清購自上海浩然生物技術有限公司；鹽酸氯普魯卡因購自上海廣銳生物科技有限公司；噻唑蘭（MTT）試劑盒、RIPA 蛋白裂解液購自美國Sigma；Transwell 小室、Matrigel、熒光定量PCR 試劑盒購于上海研卉生物科技有限公司。

1.2 細胞培養與分組

U251 細胞用RPMI-1640 培養液常規培養，取對數生長期細胞，分別用濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、9 mmol/L 的CP 培養細胞作為CP低、中、高濃度組；未經任何處理的細胞作為對照組。將si-NC、si-TTN-AS1 轉染至U251 細胞中，記為si-NC組、si-TTN-AS1組；將pcDNA、pcDNA-TTN-AS1轉染至U251 細胞中再用9 mmol/L 的CP 培養，記為CP+pcDNA組、CP+pcDNA-TTN-AS1組。

1.3 MTT 法檢測細胞增殖抑制率

細胞培養48 h，按試劑盒說明書操作，最后檢測490 nm 處吸光度（OD）值；計算細胞增殖抑制率（%）。

1.4 蛋白質印跡（Western blotting）法檢測蛋白表達

提取各組細胞總蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜、封閉，加入細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）等一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，再加入二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，顯影后分析蛋白條帶的灰度值。

1.5 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲

遷移：將100 μL 細胞懸液加入Transwell 小室上室，培 養24 h，多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數。侵襲：用Matrigel 包被Transwell 小室上室，然后與遷移操作一樣。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測lncRNA TTN-AS1表達水平

提取各組細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑盒說明以GAPDH 為內參進行擴增，相對表達量用2法計算。

2 結果

2.1 CP 對膠質瘤U251 細胞增殖的影響

相較于對照組，低、中、高濃度CP 處理可提高U251 細胞增殖抑制率和p21 表達水平，降低CyclinD1 表達水平，且呈濃度依賴性（

P

<0.05）。見圖1、表1。

圖1 氯普魯卡因（CP）對增殖相關蛋白的影響

表1 氯普魯卡因（CP）對膠質瘤U251細胞增殖的影響/± s

2.2 CP 對膠質瘤U251 細胞遷移侵襲的影響

相較于對照組，低、中、高濃度CP處理可降低遷移侵襲數及MMP-2、MMP-9的表達水平，呈濃度依賴性（

P

<0.05）見圖2、表2。

圖2 氯普魯卡因（CP）對基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白表達的影響

表2 氯普魯卡因（CP）對膠質瘤U251細胞遷移侵襲的影響/± s

2.3 CP 對膠質瘤U251 細胞中lncRNA TTN-AS1表達的影響

相較于對照組（1.00±0.09），低（0.78±0.07）、中（0.65±0.06）、高（0.52±0.05）濃度CP 處理可降低TTN-AS1 表達水平，呈濃度依賴性（

F

=78.958，

P

=0.000）。

2.4 干擾lncRNA TTN-AS1表達對膠質瘤U251細胞增殖和轉移的影響

相較于si-NC 組，干擾ln?cRNA TTN-AS1 可提高細胞增殖抑制率和p21 表達水平，減少細胞遷移侵襲數，且降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平（

P

<0.05）。見圖3，表3。

表3 干擾lncRNA TTN-AS1表達對U251細胞增殖和遷移侵襲的影響/± s

圖3 干擾lncRNA TTN-AS1表達對細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白表達的影響

2.5 lncRNA TTN-AS1 過表達逆轉了CP（9 mmol/L）對膠質瘤U251 細胞增殖和轉移的作用

相較于CP+pcDNA 組，CP+pcDNA-TTN-AS1 組細胞增殖抑制率和p21 表達水平降低，而遷移侵襲細胞數以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達水平升高（

P

<0.05）。見圖4，表4。

圖4 細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表達

表4 lncRNA TTN-AS1過表達逆轉了氯普魯卡因（CP）（9 mmol/L）對膠質瘤U251細胞增殖和轉移的作用/± s

3 討論

復發和轉移是目前腫瘤治療的難點，手術是腫瘤治療的基礎和主要方式，研究表明局部麻醉藥可影響某些腫瘤細胞的凋亡、增殖、轉移。且研究報道麻醉藥也可影響膠質瘤，研究麻醉藥對膠質瘤侵襲遷移影響，可為圍手術期合理應用麻醉藥及改善病人預后提供新思路。有研究表明，普魯卡因可抑制膀胱癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，將腫瘤細胞阻滯于G0/G1期。羅哌卡因能抑制結腸癌細胞增殖和結腸癌皮下瘤的生長。利多卡因可抑制乳腺癌和前列腺癌細胞侵襲、遷移。以上研究表明，不同麻醉藥均有一定的抑癌作用。本實驗用不同濃度的CP 處理膠質瘤細胞U251 后，U251 細胞增殖抑制率升高，細胞遷移侵襲數減少；表明氯普魯卡可抑制膠質瘤U251細胞增殖、遷移和侵襲。

研究表明lncRNA 也參與調節腫瘤的發生發展。研究報道lncRNA TTN-AS1 在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞中高表達，其表達水平與淋巴轉移、TNM 分期和病人的整體生存率有關，抑制TTN-AS1表達可抑制細胞增殖，遷移，侵襲和EMT。TTNAS1 高表達與肺腺癌病人的TNM 分期、淋巴結轉移和術后預后差也有關，敲除TTN-AS1 可抑制肺腺癌細胞增殖、遷移、侵襲。沉默TNN-AS1 明顯抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。沉默TTN-AS1 通過上調miR-1271 抑制前列腺癌的增殖和遷移。以上研究表明TNN-AS1 參與多種腫瘤的增殖和轉移等過程，還與病人的生存及預后有關。本實驗抑制TN-AS1抑制可提高細胞增殖抑制，降低細胞遷移侵襲數；說明抑制TTN-AS1 表達可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲。用不同濃度的CP處理膠質瘤細胞U251 后，TTN-AS1 表達水平顯著降低；而過表達TTN-AS1 逆轉了CP 對U251 細胞的作用。以上研究表明，CP 可能通過調控TTN-AS1 影響膠質瘤U251細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，CP 通過下調lncRNA TTN-AS1 表達可抑制膠質瘤細胞增殖和轉移。