大補陰丸對鏈脲佐菌素誘導大鼠糖尿病模型的影響

胡斌，謝玲玲，李仁杰

糖尿病在中醫文獻記載中被稱為消渴。是指以多飲、多食、多尿、身體消瘦為特征的病證。可出現繼發性急性感染、腎及視網膜等微血管病變，嚴重時出現酮癥酸中毒，甚至死亡。中醫根據癥狀及病情發展階段的不同，可將消渴可分為上、中、下三消。口渴引飲被稱為上消，善飲易食被稱為中消，飲一溲一被稱為下消。消渴多因過食甘肥或情志失調，引起臟腑燥熱、陰虛火旺所致。大補陰丸組成為熟地黃、知母、黃柏、龜板、豬脊髓，功效為滋陰降火。主治用于腎陰虛火旺證。現代常用于甲狀腺功能亢進、糖尿病等屬陰虛火旺證者。本研究自2018 年10 月至2019 年2 月研究大補陰丸對鏈脲佐菌素大鼠糖尿病模型的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠85 只，雄性，體質量范圍為180～220 g；購于廣東省醫學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（粵）2014-136。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.2 藥物及試劑

大補陰丸，杭州胡慶余堂藥業有限公司，規格60 克/瓶，批次1800370。鹽酸二甲雙胍片，中美上海施貴寶制藥有限公司，規格0.85 克/片，批號H20023371，批次LT1103071EX。檸檬酸，國藥集團化學試劑有限公司，批次20140108。檸檬酸三鈉，天津市永大化學試劑有限公司，批次20151006。鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美國sigma 公司，批次170735。水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司，批次20120720。低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）測定試劑盒，三酰甘油（TG）測定試劑盒，總膽固醇（TCH）測試盒，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。葡萄糖，天津市永大化學試劑有限公司，批次20160801。

1.3 儀器

血糖儀abbott，freestyle lite 。Leica 切片機，德國（徠卡）生產。N4 型紫外可見分光光度計，上海分析儀器廠。YG-280型烤片機：陽光神琦醫用科技有限公司。ZA120R4 型萬分之一天平，上海贊維衡器有限公司。BX53 型奧林巴斯光電顯微鏡。YG-280KX 攤片機，湖北孝感市陽光神琦醫用科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 STZ 溶液的配制

2.10 g 檸檬酸加入100 mL雙蒸水配成A 液，2.94 g 檸檬酸三鈉加入100 mL 雙蒸水配成B液，將A、B液按1∶1.32比例混合，調定溶液pH 為4.0，即是配制STZ 的0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液。將STZ 溶于0.1 mol/L 檸檬酸鈉緩沖液中，配制成濃度為11 mg/mL 的STZ 溶液，現用現配，避光配制，低溫保存。

1.4.2 分組、造模、給藥

85 只雄性SPF 級SD 大鼠采用隨機數字表法選取10只為空白對照組，其余大鼠造模后再進行分組。造模前大鼠禁食12 h，除空白對照組外其余大鼠腹腔注射濃度為11 mg/mL 的STZ（5 mL/kg）。注射STZ 的第7 天后，測隨機血糖，選擇隨機血糖大于300 mg/dL 的大鼠納入正式實驗。根據血糖值將造模大鼠采用隨機數字表法分為模型對照組、大補陰丸低劑量組（1.62 g/kg）、大補陰丸中劑量組（3.24 g/kg）、大補陰丸高劑量組（6.48 g/kg）、二甲雙胍對照組（300 mg/kg），每組10只，剔除未成模及死亡的大鼠。各給藥組灌胃體積為10 mL/kg，空白對照組及模型對照組灌胃等體積的蒸餾水。給藥12 周，末次給藥前一天測隨機血糖，末次給藥1 h 后測空腹血糖及血糖曲線下面積，實驗結束時大鼠用10% 水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，用于血脂的檢測，最后取腎臟和肝臟福爾馬林固定，用于HE染色。

糖耐量試驗：實驗時先取禁食動物血糖（為零時），然后給藥，1 h 后灌胃綿白糖（2.5 g/kg 測定給糖后0、0.5、1 及2h的血糖值以計算血糖曲線下面積）。

2 結果

2.1 大補陰丸對糖尿病模型血糖的影響

與空白對照組相比，模型對照組初始隨機血糖、治療后隨機血糖均顯著升高（

t

=12.768、12.273，

P

<0.05）。與模型對照組相比，各治療組初始隨機血糖差異無統計學意義（

P>

0.05）。與模型對照組相比，大補陰丸高劑量組、二甲雙胍對照組治療后隨機血糖顯著降低（

t

=4.072、3.116，

P

<0.05）。大補陰丸中劑量組、大補陰丸高劑量組、二甲雙胍對照組治療后隨機血糖下降率大于20%。見表1。

表1 各組初始隨機血糖、治療后隨機血糖及血糖下降率比較

與空白對照組相比，模型對照組血糖曲線下面積顯著增加（

t

=10.032，

P

<0.05）。與模型對照組相比，大補陰丸中劑量組、大補陰丸高劑量組和二甲雙胍對照組血糖曲線下面積顯著降低（

t

=3.180、4.008、5.869，

P

<0.05）。見表2。

表2 大補陰丸對糖尿病模型大鼠血糖曲線下面積的影響/± s

2.2 大補陰丸對糖尿病模型血脂的影響

與空白對照組相比，模型對照組總膽固醇和總三酰甘油顯著增加（

t

=6.003、6.272，

P

<0.05）。與模型對照組相比，大補陰丸中劑量組、大補陰丸高劑量組和二甲雙胍對照組血清總膽固醇、總三酰甘油均顯著降低（

t

=2.965、4.339、4.845，

t

=3.020、4.413、4.646，

P

<0.05）。見表3。

表3 大補陰丸對糖尿病模型大鼠總膽固醇和總三酰甘油的影響

與空白對照組相比，模型對照組低密度脂蛋白顯著增加（

t

=9.529，

P

<0.05），高密度脂蛋白顯著降低（

t

=4.255，

P

<0.05）。與模型對照組相比，大補陰丸低劑量組、大補陰丸中劑量組、大補陰丸高劑量組和二甲雙胍對照組血清低密度脂蛋白顯著降低（

t

=2.723、4.765、5.786、6.126，

P

<0.05）。與模型對照組相比大補陰丸中劑量組、大補陰丸高劑量組和二甲雙胍對照組高密度脂蛋白顯著增加（t=2.946、2.619、2.291，

P

<0.05）。見表4。

表4 大補陰丸對糖尿病模型大鼠低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的影響/± s

2.3 大補陰丸對糖尿病模型大鼠腎臟組織形態學的影響

通過HE 染色結果顯示，正常對照組大鼠的腎組織中腎小球細胞清晰，形態規則，腎小管排列整齊。與正常對照組相比模型對照組大鼠的腎組織有明顯病變，腎間質發生炎癥細胞浸潤，基膜和系膜細胞增生、腎小球肥大，腎小管排列紊亂。與模型組相比大補陰丸中劑量組、大補陰丸高劑量組和二甲雙胍對照組的腎組織病變明顯減輕，腎間質尚有散在的炎癥細胞浸潤，基膜和系膜細胞增生較輕，腎小管排列整齊，且大補陰丸對腎組織的影響呈現良好的劑量依賴性，見圖1。

2.4 大補陰丸對糖尿病模型大鼠肝臟組織形態學的影響

正常對照組大鼠肝臟結構完整，細胞核居于細胞中心，肝小葉結構正常。模型組大鼠肝小葉界限模糊，其細胞索散亂分布，肝細胞有脂肪浸潤，肝細胞水腫變性，炎癥細胞聚集。與模型組相比大補陰丸中劑量組、大補陰丸高劑量組和二甲雙胍對照組不同程度上改善大鼠肝細胞損傷，細胞排列較規則，無過多的脂肪浸潤，肝細胞水腫變性有所減輕，炎癥細胞聚集明顯減少，見圖2。

3 討論

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，因胰島素分泌缺陷或胰島素生物作用受損，長期存在的高血糖，導致腎、心血管、神經等組織的慢性損害。糖尿病患者常出現血脂代謝異常，如TCH、TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C 水平降低。糖尿病的病因至今尚未完全明確，公認糖尿病是復合病因引起的綜合征。糖尿病發病與遺傳、自身免疫及環境等因素有關。從胰島的β細胞合成和分泌胰島素通過血循環到達體內各組織器官的靶細胞，與特異性受體結合，引發細胞內物質代謝效應，在整個過程中任何一個環節發生異常均引起致糖尿病。糖尿病的代謝紊亂主要是由于胰島素生物活性絕對或相對不足引起的，臨床主要表現為易饑、多食、口渴、多飲、多尿及體質量減輕。鏈脲佐菌素可選擇性損傷胰腺β-細胞，進入胰島的β-細胞，烷化DNA，造成細胞死亡，最終胰島素分泌不足導致高血糖。給藥組動物的血糖值明顯低于對照組動物的血糖值，血糖下降率≥20%，經統計學處理，給藥組與對照組的血糖值差異有統計學意義（

P<0.05

），則可認為該藥有降血糖作用。本研究結果顯示與模型對照組相比大補陰丸高劑量組治療后隨機血糖顯著降低。與模型對照組相比大補陰丸中劑量組和大補陰丸高劑量組血糖曲線下面積顯著降低。大補陰丸中劑量組和大補陰丸高劑量組治療后隨機血糖下降率大于20%。因此可以得出大補陰丸中劑量組和大補陰丸高劑量組具有一定的降血糖作用。

目前威脅糖尿病病人生命最嚴重的并發癥為心血管病變，血管病變非常廣泛，大中小血管、動脈、毛細血管和靜脈均可累及，許多臟器發生病變，特別是心血管等大血管病變、眼底、腎臟等的微血管病變。因糖尿病患者常出現血脂代謝異常，如TCH、TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C 水平降低，因此易發生動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化見于半數以上病人，常引起心、腦、腎嚴重并發癥而致死。本研究結果顯示與模型對照組相比大補陰丸中劑量組和大補陰丸高劑量組血清總膽固醇顯著降低。與模型對照組相比大補陰丸高劑量組血清總三酰甘油顯著降低。與模型對照組相比大補陰丸低劑量組、大補陰丸中劑量組和大補陰丸高劑量組血清低密度脂蛋白顯著降低。說明大補陰丸可調節糖尿病模型大鼠脂代謝，減少動脈粥樣硬化發生的致病因素的作用。

光鏡下發現糖尿病患者微血管病變的特征為毛細血管基膜增厚，基膜中有糖類沉積，微血管病變伴有微循環異常，最為明確的是腎小球基膜，也見于腎小球系膜中。在伴有微量蛋白尿的糖尿病患者中，腎小球硬化癥中的腎小球基膜內帶負電荷的硫酸類肝素蛋白多糖含量明顯降低。細胞外基質或腎小球基膜中硫酸類肝素蛋白多醣的降低導致腎小球基膜的負電荷降低，白蛋白易于自腎小球基膜漏出，動脈也易于發生硬化。糖尿病腎小球硬化可分結節型、彌漫型及滲出型3 種。結節型毛細血管糖尿病腎小球硬化癥，腎小球毛細血管周圍有球形結節，內含PAS 陽性糖蛋白、脂質及血紅蛋白，形成網狀分層結構病變。彌漫型糖尿病性腎小球硬化，毛細血管壁增厚，由于基膜增厚，影響通透性和電荷改變，故常有微量白蛋白尿。滲出型糖尿病性腎小球硬化，腎小球囊腔中有透明而深伊紅色纖維蛋白樣物質沉積，內含三酰甘油、膽固醇及粘多糖。死于糖尿病昏迷者可發生急性腎功能衰竭伴腎小管壞死。典型糖尿病腎臟病變電鏡下示腎小球基膜增厚及基質增多擴大為特征，與糖代謝紊亂有密切關系。在糖尿病患者中肝部腫大，脂肪浸潤、水腫變性及糖原減少，脂肪肝很常見。本研究結果顯示大補陰丸中劑量組和大補陰丸高劑量組的腎組織病變明顯減輕，腎間質尚有散在的炎癥細胞浸潤，基膜和系膜細胞增生較輕，腎小管排列整齊。大補陰丸中劑量組和大補陰丸高劑量組不同程度上改善大鼠肝細胞損傷，細胞排列較規則，無過多的脂肪浸潤，肝細胞水腫變性有所減輕，炎癥細胞聚集明顯減少。

綜上所述，本研究結果表明大補陰丸可通過降低血糖及血脂水平對大鼠糖尿病模型產生保護作用。