亞甲藍對機械性腦損傷小鼠的神經保護作用及其機制研究

趙紅喜，柳楊

機械性腦損傷是一種常見的中樞神經系統損傷性疾病，隨著工業、交通等領域的快速發展，機械性腦損傷發生率逐年增加。腦損傷的病理過程包括原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷包括組織撕裂、細胞破碎及出血等，由原發性腦損傷引起的繼發性腦損傷包括水腫、炎癥反應、氧化應激及細胞壞死凋亡等。目前腦損傷的治療均以減輕繼發性腦損傷為主，目前臨床大多使用阿司匹林等非甾體類抗炎藥物或者激素類藥物以減輕炎癥反應，但由于毒副作用大，不適于長期服用。

亞甲藍（methylene blue，MB）是一種吩噻嗪類化合物，水溶性強，分子式為CHNS·Cl?3HO，相對分子質量為373.90。亞甲藍進入腦組織后，主要聚集于線粒體內部，從而調節氧化應激、炎癥反應及細胞凋亡進程等。多項研究發現亞甲藍對阿爾茨海默病、缺血性腦損傷及高原低氧所致腦損傷等神經系統疾病具有較好的治療作用。也有研究表明亞甲藍能夠通過促進自噬改善創傷性腦損傷。但是對于腦損傷所引起的細胞凋亡及炎癥反應的影響及其作用機制研究較少。核轉錄因子-κB（Nuclear Fctor-κB，NF-κB）是機體內具有調節炎癥與免疫功能的細胞因子，能夠激活促炎因子、影響細胞增殖、遷移及凋亡過程，能夠促進白細胞介素（IL）-1β，IL-6 及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達。本實驗自2019 年3―8 月通過建立機械性腦損傷模型，探討MB對機械性腦損傷小鼠的治療作用與NFκB信號通路的關系。

1 材料與方法

1.1 藥材及試劑

亞甲藍、吡咯烷二硫代甲酸銨（pynolidine dithiocarbamate，PDTC）購自Sigma 公司，IL-1β、IL-6、TNF-α 試劑盒購自默沙克生物公司，小鼠抗小膠質細胞（Iba-1）、β-actin、IκB-α 抗體、兔抗NF-κB p65、p-IκB-α 抗體購自Cell Signaling Technol?ogy（CST 公司），兔抗星形膠質細胞（GFAP）抗體購自北京博奧森，辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗小鼠、HRP 標記驢抗兔二抗購自北京鼎國，凋亡試劑盒購自南京凱基，全蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自碧云天生物。

1.2 儀器

石蠟切片機（德國徠卡公司）、紫外可見分光光度計（深圳邁瑞）、酶標儀（深圳邁瑞）、倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司），水平核酸電泳儀、半干式蛋白轉膜儀（Bio-Rad）。

1.3 實驗動物與分組

SPF級C57BL/6雄性小鼠50只，體質量范圍為20～25 g，購自遼寧長生生物有限公司［SCXK（遼）：2013-0001］，小鼠分籠飼養，自由飲食水，室溫20～25 ℃，濕度50 %。本研究中對于小鼠的處理符合動物倫理學相關標準。小鼠適應性飼養1周后，采用隨機數字表法分為以下五組：假手術組（Sham 組）、機械性腦損傷組（SWI 組）、亞甲藍組（MB組）、NF-κB抑制劑組（PDTC組）、亞甲藍聯合NF-κB抑制劑組（MB+PDTC組），每組10只。

1.4 機械性腦損傷小鼠模型的制作

利用10 %水合氯醛麻醉小鼠后，利用腦立體定位儀將其固定，酒精消毒皮膚、被毛，旋轉定位儀旋鈕至損傷位點：顱骨中線左側2 mm、人字縫前2 mm。利用顱骨鉆鉆開一圓孔，將直徑為1.0 mm 針頭垂直插入腦組織中至2 mm 處，針頭停留5 min 后拔出，止血，縫合傷口，消毒。將小鼠重新放于鼠籠中繼續飼養。Sham組只破壞顱骨，不進行刺傷。手術1 h 后腹腔注射給予MB 1 mg/kg，每天一次；Sham 組給予等體積的蒸餾水；為了抑制NF-κB 信號通路活性，PDTC 組及MB+PDTC 組分別于造模前腹腔注射100 mg/kg PDTC溶液。

1.5 小鼠神經功能評分評價

利用神經功能缺損評分（neuological severity scores，NSS）對各組小鼠于模型制備成功3、7、14 及21 d 后進行神經功能缺損評價，NSS 評分總分為18 分，正常為0 分，隨著損傷嚴重程度增加，分數逐漸升高。

1.6 TUNEL 檢測細胞凋亡

于造模完成后7 d，將小鼠麻醉，心臟灌流后取腦，包埋，冰凍切片機上進行連續冠狀切片，厚度為7 μm，利用原位末端轉移酶標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediat?ed dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）試劑盒法檢測小鼠腦內神經細胞凋亡情況，具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。每組小鼠選取6 張切片標本，顯微鏡下觀察凋亡情況，以Image J 軟件對照片中陽性細胞進行計數。

1.7 蘇木精-伊紅（HE）染色

利用HE 染色檢測腦組織病理損傷，切片置于梯度乙醇溶液水化，蒸餾水沖洗1 min；蘇木精染液加熱染色2 min，流水洗去蘇木精液；l%鹽酸乙醇分化30 s，流水洗；1% 氨水反藍30 s，流水洗；伊紅染液染色2 min，流水洗；梯度乙醇溶液脫水：80 %乙醇1 min，95% 乙醇1 min，無水乙醇1 min；切片晾干，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織學改變。

1.8 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測IL-1β、IL-6及TNF-α水平

我們于損傷后3 d，利用ELISA檢測各組小鼠腦組織中炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α 的水平變化。各組取損傷周圍腦組織100 mg，加入預冷的生理鹽水，制備成10% 腦組織勻漿液，電動勻漿器勻漿，8 000 r/min，離心20 min，取上清，隨后根據試劑盒說明書進行操作。酶標儀450 nm 波長處檢測各孔吸光度值，根據標準品吸光度，繪制標準曲線，再根據標準曲線求出各組小鼠腦組織中IL-1β、IL-6及TNF-α的含量。

1.9 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測NF-κB信號通路相關蛋白

各組取損傷周圍腦組織100 mg，加入RIPA 裂解液，電動勻漿器勻漿，10 000 r/min，離心30 min，取上清；隨后利用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，加入上樣緩沖液，加熱10 min變性，之后進行SDS-PAGE 電泳（100 V，90 min）、轉膜（250 mA，90 min）、加入相應Iba-1（1∶1 000）、GFAP（1∶2 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、IκB-α（1∶1 000）、p-IκB-α（1∶1 000）及β-actin（1∶1 000）一抗稀釋液孵育，4 ℃孵育過夜，次日室溫下孵育相應二抗（1∶2 000），ELC 顯色液顯色后，凝膠成像分析系統掃描并拍照，利用Image J軟件進行光密度分析。

2 結果

2.1 MB 降低NSS 評分

分別于損傷后3、7、14 及21 d后對小鼠神經功能進行評價，實驗結果顯示，與Sham 組相比，SWI 組小鼠NSS 評分明顯升高，差異有統計學意義（

P

<0.05）；而給予MB 治療后能夠明顯降低NSS評分，差異有統計學意義（

P

<0.05），說明MB 能夠促進SWI 小鼠神經功能恢復；給予PDTC 之后，PDTC、MB+PDTC 組與SWI 組相比NSS 評分降低不明顯，差異無統計學意義（

P

>0.05），且PDTC 與MB+PDTC 組相比，差異無統計學意義（

P

>0.05），說明PDTC 抑制了MB 改善SWI 小鼠神經功能的作用（表1）。

表1 各組小鼠神經功能缺損評分比較/(分，± s）

2.2 MB 抑制神經細胞凋亡

于損傷后7 d 利用TUNEL 試劑盒檢測神經細胞凋亡情況，觀察MB 對SWI 后大腦皮層神經細胞凋亡的影響。結果見圖1和表2，SWI組凋亡細胞數量顯著增加，與Sham組相比，差異有統計學意義（圖中藍色為細胞核DAPI，紅色為凋亡細胞，

P

<0.01），MB 組與SWI 組相比，能夠顯著降低凋亡細胞數量（

P

<0.05），說明MB 能夠減少腦損傷小鼠神經細胞凋亡。PDTC 及MB+PDTC組與SWI 組相比，T 凋亡細胞數量明顯減少，且MB組與PDTC 及MB+PDTC 組相比，差異無統計學意義（

P

>0.05），提示PDTC可抑制MB的抗凋亡作用。

表2 各組小鼠腦組織神經細胞凋亡數量比較

2.3 MB 減輕腦組織病理損傷

利用HE 染色檢測各組小鼠大腦皮層病理損傷情況，結果見圖2，Sham組皮層神經元清晰致密、染色形態正常、排列均勻、胞體飽滿、胞核呈藍色；而SWI 組傷口周圍可見大量的紅細胞，炎性細胞浸潤明顯，神經元皺縮、胞質深染、核不清晰、壞死明顯；而MB、PDTC 及MB+PDTC 組傷口周圍神經元形態明顯改善、炎癥細胞浸潤減輕、壞死細胞數量減少，紅細胞溢出情況減輕，且三組之間無明顯差別。

2.4 MB 減輕SWI所致炎癥反應

為了探究MB對SWI 引起的炎癥反應的影響，我們檢測了小鼠腦組織中炎性因子IL-1β、IL-6 及TNF-α 的表達水平；并檢測了腦組織中Iba-1、GFAP 蛋白表達情況。ELI?SA 結果顯示，SWI 組小鼠損傷皮層IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平明顯升高，與Sham 組相比，差異有統計學意義（

P

<0.01）；MB 組、PDTC 組小鼠腦組織中IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平明顯降低，與SWI 組相比，差異有統計學意義（

P

<0.05，

P

<0.01），而MB 組與PDTC 組、MB+PDTC 組相比，差異無統計學意義（

P>

0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腦組織中白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平比較/(ng/mL，± s）

Western blotting 結果顯示，小鼠腦損傷后Iba-1、GFAP 蛋白表達明顯增加，與Sham 組相比，差異有統計學意義（

P

<0.01），MB 能夠明顯減少腦內Iba-1、GFAP蛋白表達，差異有統計學意義（

P

<0.01）；PDTC及MB+PDTC 組與SWI 組相比，Iba-1、GFAP 蛋白表達明顯減少，且MB、PDTC 及MB+PDTC 組之間相比，差異無統計學意義（

P

>0.05），提示PDTC 可減弱MB對炎癥反應的抑制作用。見圖3與表4。

圖3 各組小鼠腦組織中Iba-1及GFAP蛋白表達（Western blotting檢測圖）

表4 各組小鼠腦組織中小膠質細胞（Iba-1）、星形膠質細胞（GFAP）蛋白水平比較/± s

2.5 亞甲藍抑制NF-κB 信號通路相關蛋白表達

為了研究MB 治療對SWI 小鼠腦組織NF-κB 信號通路活性的影響，我們檢測了NF-κB 信號通路相關蛋白的表達。結果顯示，與Sham 組相比，SWI 組NFκB p-65、p-IκB-α 水平顯著升高，差異有統計學意（

P

<0.05），而IκB-α 蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義（

P

<0.05）；MB 組小鼠腦組織中NF-κB p-65、p-IκB-α 蛋白表達明顯降低，而IκB-α 蛋白水平明顯升高，與SWI 組相比，差異有統計學意義（

P

<0.05）；而MB 組與PDTC 組、MB+PDTC 組相比，NF-κB 信號通路相關蛋白表達變化不明顯，差異無統計學意義（

P>

0.05，圖4 與表5），提示給予PDTC 后MB 抑制NFκB 信號通路活性的作用被阻斷，說明MB 對SWI 小鼠的治療作用可能與抑制了NF- κB 信號通路有關。

表5 各組小鼠腦組織中NF-κB p-65、IκB-α及p-IκB-α蛋白水平比較/± s

圖4 各組小鼠腦組織中NF-κB p-65、IκB-α及p-IκB-α蛋白表達（Western blotting檢測圖）

3 討論

繼發性腦損傷在損傷后數小時內發生，繼發損傷的基本機制主要包括氧自由基、神經炎癥、腦水腫和神經元凋亡。腦損傷誘發的神經炎癥主要以小膠質細胞和星形膠質細胞活化為主要特征，損傷發生后腦內的小膠質細胞和星形膠質細胞活化并遷移至損傷周圍，并且能分泌大量的炎性因子，比如，IL-6，IL-1β 和TNF-α，破壞血腦屏障，從而加劇了腦水腫、炎癥級聯反應及神經元凋亡。因此，如何抑制腦損傷后炎癥反應，減少神經細胞凋亡，恢復患者受損神經功能一直是本研究領域的關鍵。

MB 是在臨床上廣泛使用并且在治療劑量范圍內無明顯不良反應的藥物。MB 從被發現后，曾先后用于治療高鐵血紅蛋白血癥、瘧疾、氰化物中毒、膿毒血癥及外科手術的示蹤劑等。有研究表明，MB 的LD腹腔注射給藥為150 mg/kg，而靜脈給藥LD為77 mg/kg。而且一般認為，靜脈給藥劑量在10 mg/kg 以下都是安全的，并且其起治療作用的劑量通常也是低劑量，一般在4 mg/kg 以內。近年來研究表明MB 在治療中樞神經系統疾病方面具有明顯的藥理作用。MB 能夠顯著降低APP/PS1 轉基因小鼠腦實質和腦血管β-淀粉樣蛋白沉積物以及各種Aβ 物種（包括寡聚物）的水平，從而改善其認知功能障礙。MB 能夠通過上調腦源性神經營養因子來保護多巴胺能神經元，減輕MPTP 對神經元誘導的神經毒性。在腦損傷小鼠模型中，在損傷1 d 后，MB 顯著改善腦組織水腫并降低了炎性基因在巨噬細胞及中性粒細胞中表達。在我們的實驗中，我們也發現，應用MB 腹腔注射1 mg/kg 的劑量能夠明顯改善小鼠神經功能缺損評分，阻止SWI導致的神經細胞凋亡并能改善病理損傷。

腦損傷后會引發繼發性炎癥反應，表現為星形膠質細胞及小膠質細胞的異常活化及IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性因子的過度釋放。IL-1β 和TNF-α 是SWI 中最早被釋放的炎性因子，兩者還能夠發揮協同作用，共同促進其他炎性因子的生成與釋放；IL-6 也是炎癥反應過程中一個重要的炎性因子。本實驗發現MB 能顯著抑制SWI 小鼠模型腦組織中星形膠質細胞及小膠質細胞的活化，并降低損傷腦組織周圍IL-1β、IL-6和TNF-α 因子的表達，提示MB能夠通過抑制炎性因子的生成與釋放及膠質細胞活化，減輕SWI引起的炎癥反應。

NF-κB信號通路在調節細胞的生長、凋亡、分化及炎癥等方面具有重要作用，NF-κB 通路的激活可誘導IL-6，IL-1β和TNF-α等炎性因子的表達，且IL-6，IL-1β 和TNF-α 等炎性因子釋放增加也會激活NF-κB信號通路，形成反饋環路，從而誘發機體的炎癥反應。抑制NF-κB 信號通路使IκB-α 的磷酸化被抑制，并能阻止因NF-κB 從IκB-α 中釋放并轉移到細胞核后所引發的炎癥級聯反應。并且NFκB 信號通路的活化能夠參與皮層及海馬區的神經細胞凋亡，腦損傷后NF-κB 在神經細胞中廣泛表達，誘導神經細胞產生促凋亡基因及蛋白，經過級聯反應，最終導致神經元的凋亡。的本研究發現，MB 能夠顯著降低腦損傷小鼠NF-κB p-65、p-IκB-α蛋白表達，而升高IκB-α蛋白水平，說明MB對腦損傷小鼠NF-κB 信號通路相關蛋白具有調控作用。

為了探討MB 對腦損傷小鼠模型的治療作用與調控NF-κB信號通路有關，在制備SWI小鼠模型前，利用100 mg/kg 的PDTC 封閉NF-κB 信號通路，抑制其活性。結果顯示，NF-κB 信號通路被封閉后，MB 對小鼠神經功能恢復、神經細胞凋亡的影響、對炎癥反應的影響及對NF-κB 信號通路相關蛋白的調控作用被抑制，進一步說明MB 減輕繼發性腦損傷的作用機制可能是通過抑制NF-κB 信號通路活性實現的。

綜上所述，本研究表明，MB 能改善腦損傷后小鼠的神經功能、抑制細胞凋亡、減輕損傷后的炎癥反應，這可能在一定程度上與抑制了NF-κB 信號通路活性有關，但具體的分子機制還需要進一步研究。雖然目前MB 距離成為腦損傷的臨床治療藥物還有很遠的路要走，但相信在今后有一天通過劑型優化、結構修飾等手段能夠降低甚至消除亞甲藍的毒副作用，其能夠成為安全有效的腦損傷臨床治療藥物。