高效液相色譜法檢測(cè)尿毒清顆粒（無(wú)糖型）中芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮ⅡA成分的含量

孔凡鑫，王恒珍，周俊梅

尿毒清顆粒（無(wú)糖型）產(chǎn)品是由大黃、黃芪、桑白皮、苦參、白術(shù)、茯苓、白芍、制何首烏、丹參、車(chē)前草等藥味經(jīng)加工制成的中藥顆粒制劑，具有通腑降濁、健脾利濕、活血化瘀等功效，臨床主要用于慢性腎功能衰竭、氮質(zhì)血癥期和尿毒癥早期、中醫(yī)辨證屬脾虛濕濁證和脾虛血瘀等病癥的治療，對(duì)降低肌酐、尿素氮，穩(wěn)定腎功能、延緩?fù)肝鰰r(shí)間，改善腎性貧血、提高血鈣、降低血磷等有一定的作用；藥味中白芍有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)等功能，車(chē)前草有淸熱利尿通淋、祛痰、涼血、解毒等功能，丹參有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功能；據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018 年我國(guó)尿毒癥病人約有70 多萬(wàn)人，隨著人口老齡化趨勢(shì)的加劇，尿毒癥病人數(shù)量仍在持續(xù)上升階段，尿毒清顆粒（無(wú)糖型）臨床應(yīng)用越來(lái)越廣；尿毒清顆粒（無(wú)糖型）標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：WS3-229（Z-033）-2000（Z），現(xiàn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第二十六冊(cè)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中，該產(chǎn)品的含量測(cè)定項(xiàng)針對(duì)白芍藥材，即芍藥苷成分含量進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)品質(zhì)量無(wú)法得到較好的保障。本研究2020 年2―5 月建立HPLC波長(zhǎng)切換法檢測(cè)尿毒清顆粒（無(wú)糖型）中成藥中芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ成分含量的分析方法。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Perkin ElmerAltus A-10 型高效液相儀系統(tǒng)，配備在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA 檢測(cè)器（美國(guó)鉑金埃爾默公司）；Waters Spheri?sorb ODS1 液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)沃特世公司）；賽多利斯QUINTIX2102-1CN 型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯科技公司）；KQ-5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水系統(tǒng)（美國(guó)默克密理博科技公司）。

1.2 試藥

尿毒清顆粒（無(wú)糖型）3批次樣品為市售樣品，康臣藥業(yè)（內(nèi)蒙古）有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格：每袋裝5 g，批次20191121、20191218 和20200116；芍藥苷對(duì)照品（編號(hào)110736-201943，含量以95.1%計(jì)）；大車(chē)前苷對(duì)照品（批次111914-201604，含量以90.2% 計(jì)）；丹參酮Ⅱ?qū)φ掌罚ň幪?hào)110766-201721，含量以99.5% 計(jì)）等對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈：色譜純；磷酸：分析純；水為超純水；其他試劑均為分析純?cè)噭?h2>2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液

分別精密稱(chēng)取芍藥苷、大車(chē)前苷、丹參酮Ⅱ?qū)φ掌罚?0 mL 棕色容量瓶中，加90% 甲醇溶液超聲處理（功率250 W，頻率60 kHz）使溶解，加90%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成每1 mL 溶液中含芍藥苷570.6 μg、大車(chē)前苷902 μg、丹參酮Ⅱ199 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液

精密量取2.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2.5 mL，置25 mL 棕色容量瓶中，加90%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液

取尿毒清顆粒（無(wú)糖型）適量，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置50 mL棕色容量瓶中，加90% 甲醇溶液約40 mL，超聲處理30 min（功率250 W，頻率60 kHz）后取出，放冷，加90% 甲醇溶液至刻度，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液

按尿毒清顆粒（無(wú)糖型）藥材配比和處方工藝，分別制備缺白芍、車(chē)前草和丹參的陰性樣品，陰性樣品按2.1.3 供試品溶液處理，制得陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件

液相色譜柱：Waters Spherisorb ODS1液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.2% 磷酸溶液（B），梯度洗脫，按表1洗脫程序進(jìn)行；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：芍藥苷（230 nm）、大車(chē)前苷（330 nm）、丹參酮Ⅱ（270 nm）。

表1 梯度洗脫程序/%

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性考察

取2.1.2 混合對(duì)照品溶液、2.1.3供試品溶液、2.1.4 陰性對(duì)照溶液，按2.2 色譜條件，分別量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，3 個(gè)待測(cè)成分以及與其他雜質(zhì)之間均能基線分離，供試品溶液與對(duì)照品溶液中芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ色譜峰保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照溶液對(duì)3 個(gè)待測(cè)成分的檢測(cè)無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相（HPLC）色譜圖：A為混合對(duì)照品溶液；B為供試品溶液；C為缺白芍陰性對(duì)照溶液；D為缺車(chē)前草陰性對(duì)照溶液；E為缺丹參陰性對(duì)照溶液；F為試劑空白溶液

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取2.1.2 混合對(duì)照品溶液，按2.2 色譜條件，量取10 μL 注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ精密度RSD 分別為1.16%、0.78% 和0.89%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察

取2.1.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別精密移取適量，置50 mL 棕色容量瓶中，加90% 甲醇溶液定容，制備含芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ待測(cè)成分系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按2.2 色譜條件，分別量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各組分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），相對(duì)應(yīng)對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮ⅡA線性關(guān)系和范圍

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批尿毒清顆粒（無(wú)糖型）（批次20191121）樣品，按2.1.3 供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，同法平行制備6份，按2.2色譜條件，分別量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算3種待測(cè)成分的含量。結(jié)果芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ重復(fù)性RSD 分別為3.16%、3.38% 和2.69%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取尿毒清顆粒（無(wú)糖型）（批號(hào)次20191121）樣品，按2.1.3供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，按2.2 色譜條件，分別量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)色譜圖中峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ穩(wěn)定性RSD 分別為2.19%、1.46% 和2.02%，表明供試品溶液中3 個(gè)待測(cè)成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收考察

取已測(cè)定含量的尿毒清顆粒（無(wú)糖型）（批次20191121）樣品，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置50 mL 棕色容量瓶中，平行稱(chēng)取6 份，分別精密加入2.1.1對(duì)照品混合儲(chǔ)備溶液適量，后續(xù)按2.1.3 處理，制得6 份加樣回收溶液，按2.2 色譜條件，分別量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據(jù)實(shí)際檢測(cè)量和加入量計(jì)算加樣回收結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收考察結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

取尿毒清顆粒（無(wú)糖型）3批次樣品［康臣藥業(yè)（內(nèi)蒙古）有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格：每袋裝5 g，批次20191121、20191218 和20200116］，按2.1.3 供試品溶液制備方法，制備供試品溶液，按2.2色譜條件，分別量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計(jì)算3 份供試品中芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 含量檢測(cè)結(jié)果/（毫克/片）

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的確定

常用于中成藥成分檢測(cè)的方法有：紫外分光光度法、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等。尿毒清顆粒（無(wú)糖型）是由白芍、丹參、車(chē)前草等10 味藥材組成，成分較為復(fù)雜，采用紫外可見(jiàn)分光光度法，易受到其他基質(zhì)的干擾，造成檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度偏低；液相色譜-質(zhì)譜法專(zhuān)屬性好，定性、定量結(jié)果準(zhǔn)確，但儀器價(jià)格昂貴，不利于方法的推廣使用；液相色譜法專(zhuān)屬性比紫外可見(jiàn)分光光度法好，且通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，可以將不同組分有效分離，定性、定量結(jié)果準(zhǔn)確。因此實(shí)驗(yàn)選擇液相色譜法作為檢測(cè)方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

尿毒清顆粒（無(wú)糖型）是由白芍、丹參、車(chē)前草等10味藥材組成，成分較多且各成分檢測(cè)波長(zhǎng)差異較大。取2.1.2對(duì)照品混合溶液，按2.2 色譜條件，設(shè)定光譜采集范圍在200～400 nm之間，精密量取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜及光譜圖。根據(jù)譜圖可以看出：芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮Ⅱ分別在230 nm 處、330 nm 處和270 nm 處有最大吸收，3 種待測(cè)成分最大吸收波長(zhǎng)差異較大，無(wú)法采用單一波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。故本研究最終采用波長(zhǎng)切換法進(jìn)行3種待測(cè)成分含量的測(cè)定。

3.3 流動(dòng)相的確定

中成藥成分檢測(cè)場(chǎng)用的流動(dòng)相體系有甲醇和乙腈體系。實(shí)驗(yàn)分別考察甲醇-0.2% 磷酸水溶液、乙腈-0.2% 磷酸水溶液、甲醇-水和乙腈-水4 種流動(dòng)相組合體系。結(jié)果選擇甲醇體系時(shí)，丹參酮Ⅱ洗脫時(shí)間較長(zhǎng)，分析效率低下；選擇乙腈-水體系時(shí)，3 種待測(cè)成分色譜峰保留時(shí)間不穩(wěn)定，選擇乙腈-0.2% 磷酸水溶液時(shí)，3 種待測(cè)成分峰型最佳，且分析時(shí)間短。故實(shí)驗(yàn)確定流動(dòng)相體系為乙腈-0.2%磷酸水溶液體系。

3.4 提取方法的優(yōu)化

尿毒清顆粒（無(wú)糖型）藥味組成較多，基質(zhì)復(fù)雜，因此前處理方法的優(yōu)化，對(duì)于提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度有積極的作用。取尿毒清顆粒（無(wú)糖型）樣品，按2.1.3 供試品溶液處理，分別選擇甲醇、90% 甲醇溶液、80% 甲醇溶液和70%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí)，考察對(duì)3 種待測(cè)成分提取情況的影響，結(jié)果選擇80% 甲醇溶液和70% 甲醇溶液時(shí)，提取率偏低，選擇90% 甲醇溶液作為提取劑時(shí)，提取效果最佳；再分別考察提取時(shí)間（20、25、30 和35 min）和超聲功率（200、250 和300 W）的影響，最終確定90% 甲醇溶液作為提取溶劑，超聲功率控制250 W，時(shí)間控制30 min為最佳條件。

綜上，本研究建立HPLC 法檢測(cè)尿毒清顆粒（無(wú)糖型）中芍藥苷、大車(chē)前苷和丹參酮ⅡA 成分含量的分析方法，考察了建立方法的線性、重復(fù)性等參數(shù)，實(shí)驗(yàn)證明方法重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，彌補(bǔ)了單一指標(biāo)成分含量測(cè)定作為質(zhì)控手段的不足。