細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1對肺炎鏈球菌感染的肺泡上皮細(xì)胞A549損傷的影響

李峰，王罡艷，陶薪吉

肺炎是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其中肺炎鏈球菌是誘導(dǎo)肺炎發(fā)生的主要原因之一。肺炎鏈球菌能夠誘發(fā)肺泡上皮細(xì)胞凋亡和氧化損傷，從而破壞肺泡上皮完整結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肺組織損傷發(fā)生。肺泡上皮細(xì)胞有兩種，分別為I 型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞有分泌表面活性物質(zhì)的作用，能夠維持肺組織正常功能的發(fā)揮，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷也是肺炎發(fā)生的重要原因。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）是SOCS家族成員，參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等過程。研究顯示，SOCS1 表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡，并且SOCS1 還參與外界因素刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷發(fā)生過程。本研究自2019 年2―7 月以Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞來源的A549 細(xì)胞為對象，研究SOCS1 對肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響，為明確肺炎發(fā)生機(jī)制以及SOCS1 在肺炎肺泡上皮細(xì)胞損傷中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞來源的A549 細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen；丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量檢測試劑盒、JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；pcDNA3.1、pcD?NA3.1-SOCS1由北京信諾金達(dá)生物科技有限公司構(gòu)建；肺炎鏈球菌R6 購自美國ATCC；cDNA 合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（C-caspase-3）、SOCS1 抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（C-caspase-9）抗體、細(xì)胞色素C（Cytochrome C）抗體均購自美國Santa Cruz；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD）活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組處理方法

A549 細(xì)胞分成正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組共四組，Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞分別為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1、pcDNA3.1-SOCS1 的A549 細(xì)胞，模型組、Vector+ 模型組、SOCS1+ 模型組細(xì)胞分別用1×10CFU/mL的肺炎鏈球菌刺激。正常組為正常不做處理的細(xì)胞。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測SOCS1 mRNA 表達(dá)

收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞，添加PBS 溶液洗滌，然后在細(xì)胞中加入Trizol 試劑，以常規(guī)方法分別提取RNA。將RNA 溶解在DEPC 水中。反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃10 min，獲得的cDNA 在-80 ℃條件下保存，步驟同cD?NA 合成試劑盒。取cDNA，常規(guī)方法進(jìn)行SYBR Green qRT-PCR，PCR 條件為：95 ℃孵育15 s；60 ℃孵育60 s；一共40 個循環(huán)。把甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）設(shè)置為內(nèi)參，利用2方法計算SOCS1 mRNA 表達(dá)變化。引物由南京金斯瑞合成，序列如下：SOCS1 正向5，-ATGCAGTCTCCACAGCAG-3’，反向5’-CGAACGGAATGTGCGGAAGTG-3’；GAPDH正 向5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，反 向5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測SOCS1蛋白表達(dá)

收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞，分別加入蛋白提取試劑，置于冰盒內(nèi)孵育裂解約30 min，將細(xì)胞裂解液收集，并以12 000 r/min 離心10 min。吸取上清溶液，利用BCA 方法測定各蛋白樣品濃度。SDSPAGE 電泳凝膠分別使用10% 的分離膠以及5% 的濃縮膠，按照30 μg 蛋白樣品上樣。在分離膠中電泳電壓設(shè)置為90 V，觀察染料快要進(jìn)入到分離膠時，把電壓調(diào)整到120 V 繼續(xù)電泳。肉眼觀察染料進(jìn)入玻璃板的底部以后，停止電泳。取出凝膠，在冰上轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜1.5 h，電壓設(shè)置為60 V。取出PVDF膜，放在封閉液（5% 的牛血清白蛋白）中，放在室溫條件孵育2 h。將PVDF 膜放在SOCS1 抗體稀釋液中，4 ℃過夜。最后把PVDF 膜置于二抗反應(yīng)液中，于室溫環(huán)境孵育1.5 h。以ECL 方法顯色，用Bio-rad獲得圖像，內(nèi)參為GAPDH，分析目的蛋白水平。

1.5 噻唑藍(lán)（MTT）測定細(xì)胞活性

按照正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組分組方法將細(xì)胞接種到96 孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，添加20 μL MTT 溶液，繼續(xù)放在37 ℃孵育4 h。把孔內(nèi)液體吸棄，然后添加150 μLDMSO 溶液，孵育反應(yīng)10 min后，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm 的OD 值，以空白孔調(diào)零以后，以正常組細(xì)胞存活率為100%，分析模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞存活率變化。

1.6 LDH 和MDA、SOD 水平檢測

收集培養(yǎng)24 h以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，分別利用LDH 含量檢測試劑盒檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液上清中LDH 含量，以上清中LDH 含量占全部LDH 含量的百分比表示LDH 釋放率。同時利用MDA 含量檢測試劑盒和SOD 活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞中MDA含量和SOD活性，步驟完全按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞，將細(xì)胞收集并懸浮在500 μL 的結(jié)合緩沖液中，添加碘化丙啶（PI）染色液5 μL 混合，然后再添加Annexin V-FITC 染色液10 μL，充分混合后，放在避光條件下孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.8 Western blotting 檢測細(xì)胞C-caspase-3、Ccaspase-9 蛋白和線粒體、胞質(zhì)Cytochrome C 蛋白表達(dá)

收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vec?tor+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總蛋白和胞質(zhì)、線粒體蛋白，胞質(zhì)和線粒體蛋白提取步驟參照胞質(zhì)蛋白提取試劑盒和線粒體蛋白提取試劑盒，Western blotting 檢測細(xì)胞總蛋白中C-caspase-3、C-caspase-9 水平和線粒體、胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平，步驟同“1.4”。線粒體蛋白內(nèi)參為porin，其余均為GAPDH。

1.9 JC-1 法檢測線粒體膜電位

收集培養(yǎng)24 h 以后的正常組、模型組、Vector+模型組、SOCS1+模型組細(xì)胞，利用JC-1 法檢測線粒體膜電位，結(jié)果以紅綠熒光比值表示，操作步驟同線粒體膜電位檢測試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-SOCS1 提高肺炎鏈球菌感染后A549 細(xì)胞中SOCS1 表達(dá)水平

肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞中SOCS1 mRNA和蛋白水平均下降，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549細(xì)胞中SOCS1 mRNA和蛋白水平（圖1、表1）。

表1 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞中細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1（SOCS1）蛋白水平/± s

圖1 Western blotting檢測pcDNA3.1-SOCS1對肺炎鏈球菌感染后A549細(xì)胞中SOCS1蛋白影響

2.2 上調(diào)SOCS1 對肺炎鏈球菌感染的A549 細(xì)胞活性和LDH 釋放影響

肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞存活率下降，LDH 釋放率增加，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549 細(xì)胞存活率并降低LDH釋放率見表2。

表2 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞存活率和乳酸脫氫酶（LDH）釋放率/（%，± s）

2.3 上調(diào)SOCS1 對肺炎鏈球菌感染的A549 細(xì)胞SOD、MDA 水平影響

肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞SOD 活性下降，MDA 水平增加，轉(zhuǎn)染pcD?NA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549 細(xì)胞SOD 活性并降低MDA 水平。上調(diào)SOCS1 抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞氧化損傷。見表3。

表3 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平/± s

2.4 上調(diào)SOCS1 對肺炎鏈球菌感染的A549 細(xì)胞凋亡影響

肺炎鏈球菌感染后的A549細(xì)胞凋亡率和Ccaspase-3、C-caspase-9蛋白水平增加，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SOCS1可以降低肺炎鏈球菌條件下A549細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平。上調(diào)SOCS1抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡（圖2、表4）。

表4 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平/± s

圖2 上調(diào)SOCS1對肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞凋亡和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平影響：A為流式細(xì)胞術(shù)檢測A549細(xì)胞凋亡；B為Western blotting檢測C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平

2.5 上調(diào)SOCS1 對肺炎鏈球菌感染后的A549 細(xì)胞線粒體膜電位和胞漿、線粒體中Cytochrome C蛋白表達(dá)影響

肺炎鏈球菌感染后的A549 細(xì)胞線粒體膜電位下降，胞漿中Cytochrome C 蛋白水平升高，線粒體中Cytochrome C 蛋白水平降低，轉(zhuǎn)染pcD?NA3.1-SOCS1 可以提高肺炎鏈球菌條件下A549 細(xì)胞線粒體膜電位，提高線粒體中Cytochrome C 蛋白水平，降低胞質(zhì)中Cytochrome C 蛋白水平（圖3、表5）。

表5 pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞線粒體膜電位和線粒體、胞質(zhì)中細(xì)胞色素C（Cytochrome C）蛋白水平/± s

圖3 Western blotting檢測pcDNA3.1-SOCS1轉(zhuǎn)染后肺炎鏈球菌感染的A549細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白水平：A為線粒體中Cytochrome C蛋白表達(dá)；B為胞質(zhì)中Cytochrome C蛋白表達(dá)

3 討論

肺炎鏈球菌是肺炎發(fā)生的誘導(dǎo)因子，其可以刺激肺泡上皮細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞具有調(diào)節(jié)肺泡張力、維持肺泡功能的作用，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷與肺炎發(fā)展密切相關(guān)。我們的實驗顯示，肺炎鏈球菌刺激后的肺泡上皮細(xì)胞凋亡水平升高，細(xì)胞活性降低，并且細(xì)胞LDH 釋放率也增加，說明成功構(gòu)建了肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷模型。

SOCS是由細(xì)胞產(chǎn)生的信號負(fù)調(diào)控因子，其能夠抑制細(xì)胞內(nèi)多種信號的傳導(dǎo)，SOCS1是SOCS家族中最早發(fā)現(xiàn)的蛋白成員，其參與免疫交叉反應(yīng)、細(xì)胞生長等過程，SOCS1 是一個多功能調(diào)節(jié)因子。研究顯示，SOCS1 與腫瘤、腎組織損傷、冠心病等疾病進(jìn)展有關(guān)，調(diào)控SOCS1 表達(dá)可以影響疾病的發(fā)生。SOCS1 能夠減輕多種刺激因子誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，并且在不同的病理進(jìn)程中作用機(jī)制不同。近些年來的研究報道表明，SOCS1 在人肺泡上皮細(xì)胞中表達(dá)，并且與肺泡上皮細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān)，敲除SOCS1 誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡。本次實驗顯示，上調(diào)SOCS1 可以抑制肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞釋放LDH，提示上調(diào)SOCS1 具有抵抗肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷作用。

肺炎與氧化應(yīng)激的發(fā)生有關(guān)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是肺炎肺泡上皮細(xì)胞損傷發(fā)生的機(jī)制之一。肺炎發(fā)生時，肺泡上皮細(xì)胞中抗氧化酶活性降低可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧自由基的過度積累，過量的氧自由基可以將細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的MDA。SOD 是存在于細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶，其活性的高低與細(xì)胞氧化應(yīng)激水平有關(guān)。另外，過量的氧自由基能夠刺激線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，使原本存在于線粒體中的Cytochrome C 進(jìn)入胞質(zhì)，胞質(zhì)中的Cytochrome C 能夠激活Caspase-9。Caspase-9 是Caspase 蛋白家族成員，其位于Caspase 凋亡反應(yīng)的上游，其活化后可以誘導(dǎo)下游Caspase-3 的活化，而Caspase-3 活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志。我們的實驗結(jié)果顯示，上調(diào)SOCS1 可以減少肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中C-caspase-3、C-caspase-9蛋白表達(dá)，減少細(xì)胞中MDA 含量，提高SOD活性，提高線粒體膜電位，提示上調(diào)SOCS1 可能通過抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

總而言之，SOCS1 在肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，其可以減輕細(xì)胞氧化損傷、抑制細(xì)胞凋亡。這為研究SOCS1 在肺炎中的作用和機(jī)制提供了參考，為探明肺炎鏈球菌誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷分子機(jī)制提供了資料。目前對于SOCS1 的具體機(jī)制仍不明確，在以后的實驗中會繼續(xù)研究SOCS1在肺炎發(fā)生中的靶向調(diào)控機(jī)制。