骨髓間充質干細胞經Nrf2/HO?1信號通路對創傷性脊髓損傷大鼠神經的保護作用

孫啟孟，李宗明，張姣

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種包含中樞神經組織發生一系列病理生理機制及分子細胞水平變化的神經系統受損，患者死亡率及致殘率較高。伴隨地質災害、社會交通運輸業發展和其他導致脊髓損傷意外發生率不斷增大，SCI 對患者家庭和社會帶了沉重的醫療負擔。我國脊柱損傷發生率是25～35/10 萬人，約有1/6 人伴隨脊髓受損，且臨床患者多數是低于40 歲的青壯年。基于干細胞歸巢于靶區、分化潛能及自我更新等獨特特點，干細胞療法已逐漸成為臨床各種疑難雜癥研究熱點，SCI 有效療法之一為骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）移植。BMSCs 可分化、替代受損脊髓組織及分泌細胞因子等遞質，對炎癥反應抑制和內源性修復機制激活使組織修復。BMSCs 有分化為多種不同間充質譜系的能力的多能祖細胞，對治療SCI 很多病理生理學癥狀非常合適。SCI 前期階段機體內脂肪酸被膜磷脂水解而形成過氧化脂質、生物活性細胞酸，進而產生活性氧自由基。同時，高水平活性氧（reactive oxygen species，ROS）可激活白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎癥因子，導致線粒體功能障礙。氧化應激反應過程涉及了不同連續程序性和非程序性死亡，進而造成神經元凋亡。所以，我們應盡力降低受損細胞凋亡。而核因子E2 相關因子2（NFE2-Related Factor2，Nrf2）抗氧化通路是機體抗氧化應激反應主要路徑，受理化因素刺激打破了Nrf2 和Kelch 樣ECH 關聯蛋白1（Keap1）間正常聯系，Nrf2轉位到細胞核，和抗氧化反應元件相結合，細胞保護蛋白編碼基因轉錄及解毒酶激活，如血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及醌氧化還原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase1，NQO1］等。因此，本研究2019 年6―11 月分析BMSCs 移植通過Nrf2/HO-1 信號通路對SCI 大鼠神經保護影響，為臨床治療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

選取4 周齡SD 雄性大鼠10 只及8周齡雄性大鼠45只，購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號：SCXK（京）2019-21。本研究符合動物實驗倫理要求。

1.2 實驗試劑與儀器

試劑：0.25% 胰酶-EDTA 溶液（美國Sigma 公司），TNF-α 及IL-6 試劑盒（美國Abbkine公司），DMEM 培養基與胎牛血清（美國Gib?co 公司），膠原纖維酸性蛋白（collagen fibrillary acid?ic protein，GFAP）抗體、Nrf2 抗體、神經元（neuron，NeuN）抗體、HO-1抗體及NQO1抗體（美國Abcam公司）。儀器：熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），脊髓打擊器（美國PSI 公司），C6 流式細胞儀（美國BD 公司），恒溫二氧化碳細胞培養箱（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 研究方法

（1）分離、鑒定BMSCs：由10只4周齡的SD大鼠兩側股骨與脛骨內采集BMSCs，而后置入DMEM 培養基（含10% 胎牛血清，細胞數1×10/mL），對細胞生長情況采用顯微鏡監測，待細胞融合80% 至90% 時，采用含有0.25%EDTA 胰蛋白酶消化，1∶2傳代，在5% 二氧化碳、37 ℃培養箱內貼壁培養，3～5 d 傳代。表型鑒定：第4 代細胞貼壁滿瓶后消化計數，細胞密度調整為1×10/mL，選取100 L 在5 支EP 管內并標號，分別加入CD450.5 L+CD440.3 L、CD900.1 L、CD345 L+CD900.1 L、CD440.3 L和不加任何抗體的空白對照。4 ℃下避光孵育30 min，而后置入500 L PBS 溶液，離心5 min 后棄上清液。流式細胞儀鑒定BMSC 表型。多潛能分化能力鑒定：選取第3 代細胞接種于6 孔培養板，濃度為1×10/L，待細胞貼壁生長至細胞密度80% 時，在誘導孔完全培養液內置入成骨細胞誘導劑（50 mmol/L抗壞血酸磷酸鹽+1 mmol/Lβ 磷酸甘油+1 mmol/L 地塞米松）、成脂誘導劑（0.2 mmol/L吲哚美辛+1 mmol/L 地塞米松+50 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+10 mg/L胰島素）。每周換液2次，未加誘導培養液細胞作為對照。成脂細胞誘導劑誘導18 d 后，采用40 g/L 多聚甲醛固定，誘導分化脂肪細胞行油紅O 染色；成骨細胞誘導劑誘導21 d 后，采用40 g/L 多聚甲醛固定對誘導分化成骨細胞行堿性磷酸酶染色。（2）模型建立和BMSCs 移植：45 只大鼠隨機數字表法分為三組，分別為假手術組、模型組和實驗組，每組15只。大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，背部正中切口為脊椎T10節段，軟組織鈍性分離，脊椎椎板及棘突去除，假手術組縫合切口，剩余兩組使用打擊器對脊髓打擊，力度20 kPa。造模成功標準：打擊后大鼠快速出現搖尾反射，兩后肢和軀體回縮撲動，而后出現遲緩性癱瘓，脊髓表面快速呈現紫色瘀。模型組、實驗組大鼠均成功造模，造模后大鼠均存活，無傷口感染狀況，大鼠雙后肢癱瘓。成功造模后實驗組大鼠將0.5 mL 的BMSCs 細胞懸液（1×10/mL）經尾靜脈注射，模型組與假手術組大鼠注射等劑量PBS溶液。

1.4 觀察指標

（1）行為學檢測：術前、術后1、3、7、14、21 及28 d 采用運動功能評分（the Basso，Beattie，Bresnahan locomotor rating sacle，BBB）評分檢測大鼠運動功能恢復情況。BBB 評分最低0 分，說明大鼠沒有運動功能，完全癱瘓；最高評分21分，說明大鼠運動功能正常。（2）脊髓損傷7 d 后大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉，全身灌注40 g/L 多聚甲醛，選取1 cm 受損脊髓，石蠟包埋，制備為5 m 石蠟切片，行HE 染色。（3）免疫熒光染色追蹤移植細胞：為評估BMSCs分化狀況，大鼠移植后第4周，心臟灌注獲取受損脊髓組織。為鑒別移植細胞類型，采用針對GFAP（1∶50）、少突膠質細胞（CC-1，1∶50）及NeuN（1∶100）細胞標志物對分化移植細胞定位。經過表達細胞標志物GFAP、CC-1、NeuN和PKH26、DAPI共定位細胞認為是陽性細胞。每張載玻片選取6 個視野，記錄大鼠獨立區域內陽性細胞的平均數值。（4）ELSIA 檢測IL-6、TNF-α 蛋白含量：脊髓受損7 d 后選取大鼠受損脊髓組織，脊膜剝除，依據1∶1加冰生理鹽水在4 ℃下勻漿，離心后取上清液，依據試劑盒說明書進行。（5）Western blotting 檢測脊髓受損7 d后組織內Nrf2/HO-1 通路相關蛋白、凋亡相關蛋白及GFAP、NeuN 蛋白表達：常規提取細胞總蛋白，上樣電泳，80 V 電壓，溴酚藍染料至分離膠提高電壓為100 V，分離膠下泳出溴酚藍結束電泳。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜內進行蛋白質電轉移，30 mA 恒流，持續80 min。5%TBST 脫脂奶粉封閉PVDF 膜，震蕩50 min。封閉結束后洗膜3 次，每次10 min，膜移至雜交袋，置入漂洗液稀釋抗體，孵育過夜。洗膜3 次，每次10 min，置入過氧化物酶標記二抗，震蕩50 min。ECL 顯色液中將PVDF 膜溫育6 min，依次曝光、顯影、定影，IPP 軟件對掃描圖像目的條帶行灰度分析。

2 結果

2.1 BMSCs 細胞培養狀況

細胞接種24 h 后可看到小圓形細胞，貼壁細胞逐步增加；在接種5 d 后細胞分散集落，為放射狀朝四周延伸；接種7～10 d 后細胞融合達80%～90%，細胞貼附緊密，為長梭形有序排列，需傳代；細胞傳代消化時間隙變寬，細胞變圓、變短；傳代后細胞迅速貼壁，為扁平型或梭形生長，3 d 后細胞融合達50%，5～7 d 融合80%～90%，經3 至4 次傳代后形成典型扁平型或梭形排列緊密BMSCs細胞，見圖1。

2.2 鑒定BMSCs 表型

CD44CD45細胞群占比99.40%，空白對照組細胞群占比97.90%，CD90CD3 4細胞群占比80.70%，CD44細胞群占比99.20%，CD90細胞群占比91.10%，符合BMSCs 表達血細胞表面抗原標志CD44、CD90，但不表達CD45、CD34的特征，見圖2。

圖2 流式細胞儀鑒定骨髓間充質干細胞（BMSCs）表面抗原：A為空白對照；B為抗體CD90+；C為抗體CD44+；D為抗體CD90+、CD34－；E為抗體CD44+、CD45－

2.3 各組大鼠病理組織學檢測情況

假手術組脊髓組織結構正常，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠脊髓組織結構紊亂，形成空泡，大量炎性細胞浸潤；實驗組大鼠依然存在空泡，但組織結構有所改善，炎癥細胞顯著減少，見圖3。

2.4 各組大鼠BBB 評分情況

脊髓受損后7、14、21、28 d 時實驗組大鼠BBB 評分分別為（6.27±1.44）分、（11.15±1.53）分、（14.02±1.50）分、（15.14±1.60）分均高于模型組的（4.73±1.35）分、（8.52±1.49）分、（9.95±1.62）分、（11.67±1.65）分，差異有統計學意義（

t

=3.022、4.769、7.140、5.847，

P

=0.005、0.000、0.000、0.000）。

2.5 BMSCs 橫向多潛能分化能力誘導情況

加入成脂誘導劑18 d 后，誘導所形成脂肪細胞累積脂質，脂滴變大切合并成串珠狀，經染色后為鮮紅色，j見圖4A。成骨誘導培養液培養21 d后，堿性磷酸酶染色可看到細胞膜與胞質中顆粒呈陽性反應，染色為藍黑色顆粒，塊狀深染顆粒，見圖4B。

2.6 免疫熒光評估受損脊髓組織內BMSCs分化狀況

PKH26 與GFAP 蛋白共定位細胞數最多，為（52.89±10.63）% ，其次是少突膠質細胞（CC-1）（44.48±1.36）% ，NeuN 最 低 為（14.06±3.52）% ，見圖5。

2.7 各組大鼠受損脊髓組織內IL-6、TNF-α蛋白表達情況

模型組大鼠受損脊髓組織內IL-6、TNF-α蛋白表達較假手術組升高，實驗組大鼠受損脊髓組織內IL-6、TNF-α 蛋白表達較模型組降低，差異有統計學意義（

P

<0.05），見表1。

表1 各組大鼠受損脊髓組織內IL-6、TNF-α蛋白表達比較/± s

2.8 各組大鼠受損脊髓組織內Nfr2/HO-1 信號通路相關蛋白表達情況

模型組大鼠受損脊髓組織內Nfr2、NQO1、HO-1 蛋白表達較假手術組升高，實驗組大鼠受損脊髓組織內Nfr2、NQO1、HO-1 蛋白表達較模型組組升高，差異有統計學意義（

P

<0.05），見表2，圖6。

圖6 受損脊髓組織內Nfr2/HO-1信號通路相關蛋白表達條帶圖

表2 各組大鼠受損脊髓組織內Nfr2/HO-1信號通路相關蛋白表達比較/± s

2.9 各組大鼠受損脊髓組織內GFAP、NeuN 蛋白表達情況

模型組大鼠受損脊髓組織內GFAP 蛋白表達較假手術組升高，NeuN蛋白表達較假手術組降低；實驗組大鼠GFAP 蛋白表達比模型組下降，NeuN 蛋白表達比模型組上升，差異有統計學意義（

P

<0.05），見表3，圖7。

圖7 受損脊髓組織內GFAP、NeuN蛋白表達條帶圖

表3 各組大鼠受損脊髓組織內GFAP、NeuN蛋白表達比較/± s

2.10 各組大鼠受損脊髓組織內凋亡相關蛋白表達情況

模型組受損脊髓組織內Bcl-2 蛋白表達較假手術組降低，Bax 蛋白、Caspase-3 蛋白及Cleaved Caspase-3 蛋白表達較假手術組升高；實驗組受損脊髓組織內Bcl-2 蛋白表達較模型組升高，Bax 蛋白、Caspase-3蛋白及Cleaved Caspase-3蛋白表達較模型組降低，差異有統計學意義（

P

<0.05），見表4，圖8。

圖8 受損脊髓組織內相關凋亡蛋白表達條帶圖

表4 各組大鼠受損脊髓組織內凋亡相關蛋白表達比較/± s

3 討論

SCI 可繼發局部脫髓鞘、神經傳導纖維斷裂及少突膠質細胞死亡等變化，造成機體神經功能缺失。神經元無法再生，且SCI 后機體內局部微環境對軸突再生抑制，丟失神經功能恢復困難。BMSCs作為多分化細胞，具有提取容易、分離純化簡單、體外擴增方便、分化潛能多向、移植排斥反應小、無倫理學障礙等優點，移植到機體內在特定條件刺激下可分化為神經元樣細胞。Woodbury 等首先報道了體外條件下經生物與化學誘導物使BMSCs 轉化成神經元。相關研究顯示，BMSCs 可抑制受損部位氧化應激反應、減輕炎癥反應，為軸突再生提供基本骨架和有效連接，同時可分泌多種神經營養因子，為修復受損神經提供良好微環境，降低神經細胞凋亡。動物實驗研究顯示，受損模型移植BM?SCs 后，可遷移到壞死區域內填充囊性區，使脊髓空洞面積減少，有效阻止膠質瘢痕擴大，同時在局部微環境影響下可定向分化成神經元細胞與膠質細胞加速神經元軸突再生；少突膠質細胞能夠使脫髓鞘軸突重新髓鞘化，局部神經回路得以重建，代償受損細胞功能。

SCI 主要病理過程之一為氧化應激反應，HO、-OH及O·等活性氧自由基分子直接氧化脂質分子、NDA 等，造成分子結構重飾或分子降解等一系列毀滅性事件與分子失活。脊髓組織內氧化代謝中神經元為活躍狀態，但神經元抗氧化能力及再生能力有限，造成積累活性氧代謝產物及產生誘導型一氧化氮合酶（iNOS）。上述因素會導致和一氧化氮相關生化紊亂，外界理化因素更易傷害神經膠質細胞與神經元。Nrf2/HO-1 信號通路為重要抗氧化應激通路，HO-1蛋白主要影響為抗代謝使調和抗氧化應激。本文研究顯示，BMSCs 移植所介導的Nrf2/HO-1 信號通路可保護神經元免受損傷，而HO-1 起到要關鍵影響，有研究顯示HO-1 在細胞外和細胞內均可發揮保護影響，同時，HO-1 為HO誘導氧化損傷內預防氧化應激主要效應物。細胞凋亡為SCI后繼發性損傷，是不同信號轉導機制調節程序性細胞死亡過程，在神經元凋亡中Bcl-2、Bax 及Caspase蛋白有重要影響。本文研究顯示，實驗組受損脊髓組織內Bcl-2 蛋白表達較模型組升高，Bax 蛋白、Caspase-3 蛋白及Cleaved Caspase-3 蛋白表達較模型組降低，差異有統計學意義，說明BMSCs 移植對細胞凋亡信號通路有抑制作用。

SCI 病理后期，機體內再生神經軸突會形成膠質瘢痕阻礙及Wallerian 變性，且病灶位置活化星形膠質細胞反應增生，突起增多并延伸參與吞噬。清除受損區域后該空隙被星形膠質細胞突起所填補，為化學性或機械性屏障而阻礙神經再生。產生膠質瘢痕后對微血管形成與延伸阻滯，同時小血管收縮對局部血供造成影響。另外，伴隨反應性膠質細胞的形成可同時產生大量一氧化氮，造成NDA 毒性變化使神經元發生遲發性壞死。本文研究顯示，實驗組GFAP 蛋白表達比模型組下降，NeuN 蛋白表比較模型組上升，說明BMSCs 移植可保護脊髓神經元可免于壞死同時對星形膠質細胞激活抑制。SCI 后細胞因子和炎癥因子激活了免疫細胞與星形膠質細胞，加速并維持炎癥反應。IL-6 與TNF-α 可誘導SCI 后期少突膠質細胞與神經元死亡，造成感覺與運動神經元功能障礙，產生炎癥級聯反應。本文研究顯示，驗組大鼠受損脊髓組織內IL-6、TNF-α蛋白表達較模型組降低，差異有統計學意義，說明BMSCs移植能夠降低炎癥反應對組織的損傷。

綜上所述，BMSCs 移植可抑制SCI 大鼠星形膠質細胞活化和神經細胞凋亡，減輕炎癥反應，加速恢復運動神經功能，其作用機制可能和Nrf2/HO-1信號通路激活有關。由于時間和人力等條件限制，本研究中部分數據難免存在偏頗，且對Nrf2/HO-1信號通路的具體影響機制未明確，今后將進一步學習相關的知識以進行更大樣本量、更深入的探究。