病毒性腦炎病兒腦脊液中微小RNA-21表達水平與輔助性T細胞17/調節性T細胞平衡的相關性分析

葛莉，朱麗

病毒性腦炎是一種中樞神經系統感染性疾病，以顱壓增高、發熱、精神及意識障礙等臨床癥狀為突出表現，以腦實質為主要病理改變，在兒童及成人中均可發病，但多見于兒童群體。病毒性腦炎的發病與病毒感染有關，其中，可引起本病的病毒高達一百多種。而流行病學顯示，病毒性腦炎表現出流行性、散發性特點，發病率可達7/10 萬，若救治不及時，輕者遺留后遺癥，重者可導致患者死亡，這給其家庭帶來了巨大的心理負擔。因此，探求病毒性腦炎可能的發病機制、干預靶點一直是研究者們的重要研究內容。輔助性T 細胞17（helper T cell 17，Th17）、調節性T 細胞（regulatory T cell，Treg）是T細胞中免疫應答功能不同的兩種類型，彼此存在拮抗關系，已有研究表明病毒性腦炎患者體內Th17/Treg 處于失衡狀態。microRNA-21（miR-21）是mi?croRNA 的一種，能通過多種方式影響免疫細胞的生長、分化，但這一點在病毒性腦炎中尚未得到證實。本研究擬通過檢測病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 表達水平及Th17、Treg 細胞比例，分析腦脊液miR-21水平與Th17/Treg平衡的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年9 月至2019 年7 月在撫順市中心醫院兒科就診的急性期病毒性腦炎病兒（觀察組）108 例作為研究對象，根據臨床癥狀、體征和輔助檢查結果進一步分為兩亞組：輕癥組（輕癥病毒性腦炎病兒，57 例）和重癥組（重癥病毒性腦炎病兒，51 例），選取同期撫順市中心醫院兒科出院前復查已康復的病毒性腦炎病兒（對照組）110 例作為對照。收集兩亞組、對照組性別、年齡等一般資料。

納入標準：（1）病毒性腦炎的診斷標準與《傳染病學（第8 版）》中有關描述相符，其中，當病毒性腦炎病兒符合頻繁抽搐或驚厥持續、肢體癱瘓癥狀、頭部CT/MR 檢查提示腦干出現異常密集灶或腦實質、意識障礙中至少兩條描述時，納入重癥組，否則納入輕癥組。（2）所有受試兒童監護人對本研究知情并簽署紙質版知情同意書。

排除標準：（1）患有惡性腫瘤、血液系統疾病、免疫系統疾病、生長發育異常、中樞神經系統病變、先天性心肝腎功能異常及其他顱腦病變病兒。（3）近期使用糖皮質激素、免疫抑制劑等藥物。（4）不服從檢測安排者。（5）資料不真實或不全者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試劑與儀器

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（型號：ABI 7500 Sequence De?tection System）購自美國Applied Biosystems 公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。人白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）酶聯免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號EK0410、EK0416、EK0430）購自上海彩佑實業有限公司；人轉化生長因子-β（TGF-β）ELISA 試劑盒（貨號C505058）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酶標儀（型號MODEL550）購自美國Bio-Rad 公司；流式細胞儀（型號FACS CantoⅡ）購自美國BD公司；流式細胞儀采用的流式抗體均購自美國eBio?science公司。

表1 引物序列表

1.3 腦脊液采集及指標檢測

所有受試者均行無菌腰椎穿刺術，常規抽取腦脊液分成3份待檢。

一份qRT-PCR法檢測miR-21相對表達量，試劑盒法提取總RNA，反轉錄成cDNA，以U6 為內參，熒光定量PCR 檢測miR-21 相對表達量，每個樣本3 次重復，2法計算miR-21相對表達量。

一份采用ELISA 法檢測IL-6、IL-10、IL-17、TGFβ 水平，試驗方法均按照試劑盒說明書進行。酶標儀于波長450 nm 處測定吸光度（值，3 次重復，繪制標準曲線，根據樣品OD 值計算IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β水平。

一份流式細胞儀分析Treg、Th17 細胞水平，密度梯度離心法提取單個核細胞（peripheral blood mono-nuclear cell，PBMCs），PBS 重懸PBMCs 細胞，取細胞懸液20 μL 分成2 份，調節細胞濃度后分別加入流式細胞儀抗體，其中，Treg管的單克隆抗體采用Foxp3 Alexa Fluor488/CD25 PE/CD4 PerCP，Th17管的單克隆抗體采用IL-17 Alexa Fluor647/CD3 FITC/CD4 PE，試驗方法均嚴格按照流式細胞檢測說明書進行，流式細胞儀上檢測Treg細胞和Th17細胞水平，結果用FACS Express 3.0 軟件分析，計算Treg、Th17和Treg/Th17。

2 結果

2.1 病兒一般資料比較

對照組與觀察組，輕癥組與重癥組受試兒童性別、年齡均差異無統計學意義（

P

>0.05），具有可比性。見表2，3。

表2 病毒性腦炎對照組與觀察組一般資料比較

表3 病毒性腦炎輕癥組與重癥組一般資料比較

2.2 兩組腦脊液中miR-21、Th17、Treg、Th17/Treg水平比較

與對照組比較，觀察組腦脊液中miR-21、Th17、Th17/Treg 水平明顯升高（

P

<0.05），Treg 水平明顯降低（

P

<0.05）。見表4。

表4 病毒性腦炎對照組與觀察組腦脊液中微小RNA-21（miR-21）、輔助性T細胞17（Th17）、調節性T細胞（Treg）、Th17/Treg水平比較/± s

2.3 兩組腦脊液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平比較

研究結果顯示，與對照組比較，觀察組病毒性腦炎病兒腦脊液中IL-6、IL-17 水平明顯升高（

P

<0.05），IL-10、TGF- β水平明顯降低（

P

<0.05）。見表5。

表5 病毒性腦炎對照組與觀察組腦脊液中白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）、轉化生長因子-β（TGF-β）水平比較/（ng/L，± s）

2.4 不同嚴重水平病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21、Th17、Treg、Th17/Treg 水平比較

與輕癥組相比，重癥組病兒腦脊液中miR-21、Th17、Th17/Treg水平明顯升高（

P

<0.05），Treg 水平明顯降低（

P

<0.05）。見表6。

表6 病毒性腦炎輕癥組與重癥組腦脊液中微小RNA-21（miR-21）、輔助性T細胞17（Th17）、調節性T細胞（Treg）、Th17/Treg水平比較/± s

2.5 不同嚴重水平病毒性腦炎病兒腦脊液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平比較

與輕癥組相比，重癥組腦脊液中IL-6、IL-17 水平明顯升高（

P

<0.05），IL-10、TGF-β水平明顯降低（

P

<0.05）。見表7。

表7 病毒性腦炎輕癥組與重癥組腦脊液中白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）、轉化生長因子-β（TGF-β）水平比較/（ng/L，± s）

2.6 病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21、Th17/Treg水平與IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平的相關性

相關性分析結果顯示，病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 水平、Th17/Treg 水平與IL-6、IL-17 水平均明顯正相關（

P

<0.05），與IL-10、TGF-β 水平均明顯負相關（

P

<0.05）。見表8。

表8 病毒性腦炎病兒腦脊液中微小RNA-21（miR-21）、輔助性T細胞17（Th17）/調節性T細胞（Treg）水平與白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-17（IL-17）、轉化生長因子-β（TGF-β）水平的相關性分析

2.7 病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 水平與Th17/Treg 的相關性

相關性分析結果顯示，病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21 水平與Th17/Treg 明顯正相關（

r

=0.553，

P

<0.05）。見圖1。

圖1 病毒性腦炎病兒腦脊液中微小RNA-21（miR-21）與輔助性T細胞17（Th17）/調節性T細胞（Treg）的相關性分析

3 討論

病毒性腦炎是兒科常見疾病，當病兒機體抵抗力低時，病毒可侵犯人體中樞神經系統，對中樞神經組織細胞造成損害。其中，病毒對機體的損害機制可具體分為直接損害和間接損害，直接損害為病毒及其釋放的毒素對腦組織、腦細胞造成的損傷，間接損害為病毒及其釋放的毒素激活顱內免疫應答反應后，產生的大量炎性因子對局部腦組織、腦細胞造成的損害。有研究表明，與直接損害相較，間接損害對治療后不良事件發生的影響更為嚴重。T細胞是人體主要的免疫細胞，參與病毒感染機體后的免疫應答反應，而CD4T 細胞作為T 細胞的重要類型，在病毒及其釋放的毒素刺激下可分化為多個亞群，其中，Th17、Treg 是維持免疫穩定、免疫耐受過程的兩個重要亞群，彼此聯系緊密，功能相互抑制，當機體運行正常時保持動態平衡，共同維持機體的免疫內環境穩定，當免疫應答激活后，Th17/Treg 狀態失衡引起炎癥反應，參與疾病發病后的免疫調控。

有研究表明，初始T 細胞分化發育方向受制于所處周圍環境，當機體周圍環境中IL-1β、IL-6 和TGF-β 濃度處于高水平時，初始T 細胞分化發育方向趨向于Th17 細胞，由Th17 細胞調控分泌的IL17、IL-6、IL-23 等細胞因子隨之增加；當周圍環境中只有TGF-β 處于高水平時，初始T 細胞分化發育方向趨向于Treg 細胞，由Treg 細胞調控分泌等IL-4、IL-10、TGF-β 細胞因子隨之增加。本研究中，隨著病毒性腦炎的發生與病情的加重，患者腦脊液中Treg、IL-10、TGF-β 水平明顯降低，Th17、Th17/Treg、IL-6、IL-17 水平明顯升高，且Th17/Treg 與IL-10、TGF-β 水平明顯負相關，與IL-6、IL-17 水平明顯正相關，這表明病毒性腦炎患者體內存在免疫調控，Treg、Th17、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 均參與其中。Zhang 等研究表明，IL-6 是決定Th17、Treg 分化相對比例的重要細胞因子，本研究結果與之一致。且IL-6 水平升高導致初始T 細胞向Th17 細胞分化后，進一步導致由Th17 分泌的IL17、IL-6 水平升高，由Treg 分泌的IL-10、TGF-β 水平水平降低，如此循環往復，Th17/Treg呈現出失衡狀態。

miR-21 是非編碼小片段RNA 分子miRNA 中的一員，與自身免疫性疾病、癌癥、腎臟疾病、心血管疾病、炎癥相關性疾病中均密切相關。謝子英等研究發現，miR-21 與急性胰腺炎患者細胞內感染程度、免疫應答、炎癥反應具有相關性，推測miR-21表達上調可影響機體全身性炎癥反應爆發，導致IL-6、IL-8、TNF-α 等炎性因子的過量釋放。姚紹鑫等研究表明，肝癌大鼠外周血miR-21 水平上調，與Treg/Th17比值明顯正相關，但具體分子生物學調控機制未知。但在于海奕等人的研究中，大鼠心肌細胞IL-6 水平增加后，可通過增強STST3 活性促進miR-21 的轉錄表達，共同參與心室重構。本研究中，隨著病毒性腦炎的發生與病情的加重，患者腦脊液中miR-21 水平明顯升高，與IL-10、TGF-β 水平明顯負相關，與IL-6、IL-17、Treg/Th17水平明顯正相關，這表明miR-21參與病毒性腦炎的發生及病情加重過程，與IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、Treg/Th17 均有明顯的相關關系。結合前人研究，本研究結果表明，病毒性腦炎腦脊液中miR-21 表達上調，可能與IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平相互影響，共同參與免疫調控，即Th17/Treg的失衡過程。

綜上所述，病毒性腦炎病兒腦脊液中miR-21表達水平、Th17/Treg 均明顯增加，兩者明顯正相關，miR-21 水平升高可能對Th17/Treg 失衡有促進作用。雖然研究結果表明，miR-21 對Th17/Treg 失衡的影響可能有IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 的參與，但具體機制尚需進一步研究。