長鏈非編碼RNA PCGEM1及信號傳導轉錄激活因子3在卵巢癌中的表達及意義

楊長香，韓自旺，史天云

卵巢癌是女性生殖器官常見惡性腫瘤之一，好發于絕經期女性，發病率僅次于宮頸癌和子宮體癌，且近年來呈逐漸上升趨勢，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌發病早期無特異性癥狀，70%病人確診時已為中晚期，導致治療效果及預后差，至今5 年生存率不超過30%，嚴重威脅女性生命健康。因此，尋找特異性反應卵巢癌早期病理特征的腫瘤標志物成為近來臨床研究熱點。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類在多物種中具有高度保守性的非編碼RNA，研究發現，lncRNA 在卵巢癌的發生發展中發揮主要作用。有研究報道，lncRNA PCGEM1 可通過RA 通路誘導卵巢癌發生發展。信號傳導轉錄激活因子3（signal transducer and acti?vator of transcription proteins3，STAT3）具有信號轉導和轉錄調控雙重功能，研究顯示，STAT3異常表達與卵巢癌、乳腺癌等密切相關。有研究發現，ln?cRNA PCGEM1 可通過上調STAT3 表達參與子宮內膜癌的發病及病情進展。然而關于LncRNA PC?GEM1 和STAT3 在卵巢癌中的關系及作用鮮有研究。因此本研究擬觀察卵巢癌及正常卵巢組織中LncRNA PCGEM1 和STAT3 表達水平，并分析二者與病人預后的關系，旨在為預后評估提供輔助依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013 年3 月至2014 年12 月在南陽市第一人民醫院行卵巢摘除手術的卵巢癌病人108例，均經術后病理確診，年齡（55.14±8.53）歲，范圍為35～70 歲。根據2000 年國際婦產科聯盟臨床分期（FIGO）分為：Ⅰ+Ⅱ期59 例，Ⅲ+Ⅳ期49例；病理分級：G1+G2級62例，G3級46例；淋巴結轉移49 例，無淋巴結轉移59 例；鉑類耐藥41 例，鉑類敏感67 例。另因卵巢囊腫需作手術切除但已證實無腫瘤細胞的正常卵巢組織108 例，年齡（53.69±9.18）歲，范圍為35～69 歲。兩組年齡比較，差異無統計學意義（

t

=1.202，

P

=0.230），具有可比性。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入、排除標準

納入標準：（1）經病理確診為卵巢癌或良好性卵巢囊腫病人；（2）均行卵巢摘除術；（3）成年女性；（4）半年內未接受放化療或其他抗腫瘤藥物治療；（5）病人及其近親屬均知情同意。

排除標準：（1）有其他婦科疾病或惡性腫瘤者；（2）心、肝等功能異常者；（3）月經期婦女；（4）資料缺失。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

術中收集的卵巢癌及正常卵巢組織標本，分兩份，一份離體后置于液氮中保存，用于檢測lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達水平；另一份制成石蠟標本，用于檢測STAT3蛋白表達。

1.3.2 檢測lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達水平

采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測卵巢癌及正常卵巢組織中ln?cRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 相對表達量，儀器購自美國Bio-Rad 公司。采用RNA 提取試劑盒（編號R0011，上海碧云天有限公司）提取組織總RNA，其濃度及純度合格后反轉錄得到cDNA，檢測濃度及純度的儀器為紫外分光光度計，置于-20 ℃保存備用。qRT-PCR 反應采用20 μL 體系：TB Green Pre?mix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2× ）（ 編 號RR820A，TaKaRa 生物公司）10 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL ，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（由上海生工合成）（10 μmol/L）各0.8 μL，ddHO 6.0 μL。 反應 條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s；60 ℃34 s，40 個循環。lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 及內參β-actin 的引物序列見表1。利用公式2計算lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.3 檢測STAT3 蛋白表達水平

石蠟組織連續切片，厚約4 μm，接下來進行烘烤、脫水、蘇木素復染等處理。由2名經驗豐富醫師共同對染色結果進行半定量評分，方法為雙盲法。STAT3 蛋白陽性主要表達在細胞質或核內，主要呈黃色或棕色顆粒。采用免疫反應積分（IRS）法評估染色情況：（1）染色強度（SI）積分，無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別為0、1、2、3 分；（2）陽性染色細胞百分比（PP）積分，陰性為0 分，PP 1%～10% 為1 分，PP 11%～50% 為2分，PP 51%～75% 為3 分，PP 76%～100% 為4 分。IRS = SI×PP，IRS>3為陽性。

1.4 隨訪

對出院后的卵巢癌病人進行為期1～60個月的隨訪，隨訪方式為打電話或門診復查，隨訪頻率為每月1 次，以病人死亡或隨訪至2019 年3 月31 日終止，記錄病人隨訪期間生存情況，便于進行統計分析。

2 結果

2.1 卵巢癌及正常卵巢組織中lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達水平比較

卵巢癌組織中ln?cRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表達水平均明顯高于正常卵巢組織（

P

<0.05）。見表2。

表2 卵巢癌及正常卵巢組織中長鏈非編碼RNA PCGEM1（lncRNA PCGEM1）與信號傳導轉錄激活因子3（STAT3）mRNA表達水平比較/± s

2.2 STAT3 蛋白在卵巢癌及正常卵巢組織中陽性表達水平比較

STAT3 蛋白在細胞核及細胞質中均有表達，呈棕黃色顆粒。與正常卵巢組織比較，卵巢癌組織中STAT3 蛋白陽性表達率顯著升高，均差異有統計學意義（

P

<0.05）。見表3，圖1。

表3 正常卵巢及卵巢癌組織中信號傳導轉錄激活因子3（STAT3）蛋白陽性表達率比較/例（%）

2.3 lncRNA PCGEM1 及STAT3 蛋白表達水平與卵巢癌臨床病理參數的關系

STAT3蛋白陽性表達組76 例和陰性表達組32 例，以lncRNA PCGEM1 表達水平平均數（2.41）為界，分為lncRNA PCGEM1 高表達組（≥2.41）62 例和低表達組（<2.41）46 例。ln?cRNA PCGEM1 及STAT3 蛋白表達水平與卵巢癌病人的年齡無關（

P

>0.05），與FIGO分期、病理分級、是否鉑類耐藥、有無淋巴結轉移有關（

P

<0.05）。見表4。

表4 長鏈非編碼RNA PCGEM1（lncRNA PCGEM1）及信號傳導轉錄激活因子3（STAT3）蛋白表達水平與卵巢癌臨床病理參數的關系/例（%）

2.4 lncRNA PCGEM1及STAT3 mRNA 水平相關性分析

Pearson 法分析結果顯示，卵巢癌組織中lncRNA PCGEM1 及STAT3 mRNA 水平呈正相關（

r

=0.575，

P

<0.05）。見圖2。

圖2 卵巢癌組織中lncRNA PCGEM1及STAT3 mRNA水平相關性分析

2.5 生存曲線分析

隨訪5 年，108 例卵巢癌病人總生存率為29.63%（32/108）。lncRNA PCGEM1 高表達組5 年生存率為8.33%，顯著低于低表達組54.35%（χ=39.51，

P

<0.001），STAT3 蛋白陽性表達組5 年生存率為13.16%，顯著低于陰性表達組68.75%（χ=26.16，

P

<0.001）。

2.6 COX 分析影響卵巢癌病人預后的危險因素

COX 多因素分析顯示，順鉑耐藥、淋巴結轉移、ln?cRNA PCGEM1高表達、STAT3蛋白陽性表達是影響卵巢癌病人預后的獨立危險因素（

HR

=3.569，95%

CI

為2.114～6.025；

HR

=3.563，95%

CI

為1.827～6.949；

HR

=2.786，95%

CI

為1.495～5.192；

HR

=1.897，95%

CI

為1.161～3.096，均

P

<0.05），見表5。

表5 影響卵巢癌病人預后的危險因素分析結果

3 討論

LncRNA 參與多種生物過程，具有調控細胞增殖、分化等過程的作用，與多種惡性腫瘤的發生密切相關。隨著芯片技術和高通量測序方法的進步，越來越多LncRNA 被發現，約1 749 種與卵巢癌有關。Chen 等研究發現，上皮性卵巢癌組織中LncRNA PCGEM1 表達水平較正常卵巢上皮組織高。Li 等研究證實，與正常子宮內膜組織比較，LncRNA PCGEM1 在子宮內膜癌組織中表達上調，且lncRNA PCGEM1 可上調STAT3 的表達，影響子宮內膜癌的發生和發展。而STAT3 是一類以二聚體形式進入細胞核與靶DNA 序列結合、相對分子質量為92 kDa 的轉錄因子，主要存在于細胞質，可被多種細胞因子或其他胞外信號激活發揮生物學作用。正常生理狀態下，STAT3 蛋白的激活短暫而迅速，而STAT3 過度表達、持續激活與卵巢癌等多種惡性腫瘤血管生成、細胞增殖凋亡有關。王慶濤等研究發現，乳腺癌組織中STAT3 陽性表達率顯著高于癌旁組織。雷波等研究發現，Th22 細胞通過釋放IL-22 活化STAT3 通路，使卵巢癌組織中STAT3 磷酸化蛋白表達水平顯著高于癌旁組織，以促進卵巢癌的發展。本研究結果發現，卵巢癌組織中lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表 達 水 平 及STAT3 蛋白陽性表達率顯著高于正常卵巢組織，且二者呈正相關，提示lncRNA PCGEM1 高表達、STAT3 蛋白陽性表達可能共同作用，與卵巢癌發生有關。

Chen 等研究發現，lncRNA PCGEM1 表達水平與卵巢癌病理分級有關。王慶濤等研究發現，STAT3 蛋白陽性表達與乳腺癌FIGO 分期、TNM 分期有關。本研究結果發現，卵巢癌組織中lncRNA PCGEM1 高表達、STAT3 蛋白陽性表達與病人FIGO分期、病理分級、鉑類耐藥及淋巴結轉移有關，提示lncRNA PCGEM1 高表達、STAT3 蛋白陽性表達可能與卵巢癌的病情進展有關。李碩果等研究顯示，STAT3在食管癌中高表達且可能與食管癌病人預后差有關。王慶濤等發現，STAT3 高表達乳腺癌病人生存期短，預后差。本研究生存分析發現，ln?cRNA PCGEM1 高表達、STAT3 蛋白陽性表達病人5年生存率顯著低于lncRNA PCGEM1 低表達、STAT3蛋白陰性表達病人，提示lncRNA PCGEM1 高表達、STAT3 蛋白陽性表達可能影響卵巢癌病人生存期。進一步COX 多因素分析結果顯示，除順鉑耐藥和淋巴結轉移因素外，lncRNA PCGEM1 高表達、STAT3蛋白陽性表達是影響卵巢癌病人預后的獨立危險因素，再次表明lncRNA PCGEM1 高表達、STAT3 蛋白陽性表達與卵巢癌病人預后差密切相關，有潛力成為監測卵巢癌病情進展及預后評估的標志分子。

綜上所述，卵巢癌組織中lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 及蛋白高表達，二者高表達與病人FI?GO 分期、病理分級等臨床病理參數及5年生存情況有關，檢測二者表達有利于早期評估病人預后。但關于lncRNA PCGEM1、STAT3 與卵巢癌發生發展的具體作用機制及二者具體調控關系尚有待進一步加大樣本量、深入研究。