紫草素對肺炎鏈球菌引起的肺炎小鼠細胞外信號調節激酶/p38絲裂素活化蛋白激酶/核苷酸結合寡聚化結構域樣蛋白3信號通路及肺血管通透性的影響

衛麗，劉虹，閆鮮鵬

肺炎鏈球菌是一種革蘭陽性雙球菌，是引起腦膜炎、社區獲得性肺炎等炎癥性疾病的主要病原體。研究報道，每年約有160 萬人死于肺炎鏈球菌性肺炎，危害嚴重。目前臨床治療肺炎鏈球菌性肺炎仍主要以抗生素為主，但萬古霉素類、大環內酯類等耐藥菌株的出現正嚴重影響肺炎鏈球菌性肺炎的治療效果，因此急需尋找非抗生素類有效替代藥品。紫草素是一種由草本植物紫草根部提取的萘醌化合物，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種藥理活性。絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路是細胞增殖、分化、凋亡、炎癥及應激等信號轉導通路的交匯通路之一，其中細胞外信號調節激酶（extracellular signalregulated kinase，ERK）、p38 MAPK（p38）屬MAPK 兩個不同亞族，近來研究發現，ERK 和p38信號通路是介導肺炎鏈球菌誘導的肺部炎癥反應的關鍵信號分子，而紫草素可通過抑制p38 通路抑制肺纖維細胞增殖和活化。另核苷酸結合寡聚化結構域樣受 體 蛋 白3（nucleotide binding oligomerization do?main like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體在機體固有免疫應答及炎癥反應中起重要作用，可參與急性肺損傷。但關于紫草素對肺炎鏈球菌性肺炎肺血管通透性及ERK/p38/NLRP3 信號通路的影響尚鮮有研究，因此本研究2020 年1―5 月通過建立肺炎鏈球菌性肺炎小鼠模型，探究紫草素對其肺血管通透性及ERK/p38/NLRP3 信號通路的影響，以期揭示其作用機制，為臨床肺炎鏈球菌性肺炎治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 周齡SPF 級雄性BALB/c 小鼠，體質量16～18 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0002。本研究經陜西省人民醫院動物倫理委員會批準通過，符合動物使用指南。

1.2 主要試劑及儀器

紫草素（貨號S7576，HPLC≥98%）購自Sigma-Aldrich 公司；頭孢呋辛酯（批號H20000399）購自廣東立國制藥有限公司；肺炎鏈球菌標準菌株ATCC 49619 購自廣東微生物菌種保藏中心。RNA 提取試劑盒（貨號R0011）、BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0010S）均購自上海碧云天生物科技有限公司；PrimeScript?Ⅱ1st Strand cDNA Syn?thesis Kit（貨號6210A）、TB Green? Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（貨號RR820A）均購自TaKaRa公司；引物由華大基因合成；小鼠腫瘤壞死因子（tu?mor necrosis factor，TNF）-α ELISA 試劑盒（貨號MM-0132M2）購自南通飛宇生物科技有限公司；小鼠白細胞介素（IL）-1β ELISA 試劑盒（貨號ZC-37974）購自上海茁彩生物科技有限公司；兔源一抗anti-ERK1/2（貨號76299）、anti-p38（貨號ab170099）、an?ti-p-p38（貨號ab4822）、anti-NLRP3 抗體（貨號ab214185）、anti-GAPDH 抗體（貨號ab9485）、二抗羊抗兔IgG（貨號ab6721）均購自英國Abcam 公司。Evolution 220 紫外分光光度計、FC 型酶標儀、ABI 7500 RT-qPCR儀均購自美國Thermo Fisher公司等。

1.3 方法

1.3.1 模型制備及分組

BALB/c 小鼠適應性飼養1 周后，進行乙醚輕度麻醉，鼻腔內接種肺炎鏈球菌D39 標準株溶液6×10CFU/mL 0.1 mL/只，連續3 d。檢測其感染表現，以小鼠體質量不增、出現呼吸急促、安靜少動、脫毛等感染表現為肺炎鏈球菌性肺炎模型制備成功。成模后小鼠按照隨機數字表法分為模型組、紫草素低、中、高濃度組及頭孢呋辛酯組，另取鼻腔滴加等量生理鹽水小鼠為對照組，每組10 只。紫草素低、中、高濃度組分別灌胃紫草素12.5 mg/kg、25.0 mg/kg、50.0 mg/kg，頭孢呋辛酯組灌胃頭孢呋辛酯50.0 mg/kg，對照組、模型組灌胃等量生理鹽水，每天1 次，連續7 d。末次給藥12 h后麻醉處死小鼠，采集肺組織進行相關指標檢測。

1.3.2 小鼠肺組織W/D 比值測定

取各組大鼠左肺上葉組織稱濕重（wet weight，W），置于70 ℃干燥箱烘干至恒重后稱干重（dry weight，D），并計算左肺組織W/D比值。

1.3.3 小鼠肺組織肺血管通透性檢測

給藥結束后，每組采用隨機數字表法選取4只小鼠，稱重后尾靜脈注射2% 伊文藍20 mg/kg，30 min 后麻醉處死，打開胸腔暴露心肺，沖洗肺血管，剪除心臟與肺門組織，除去肺周圍水分及血液，取100 mg 左肺組織小塊以體積比7∶3添加丙酮-生理鹽水溶液3 mL，置于37 ℃溫箱24 h，之后離心取上清采用紫外分光光度計檢測620 nm 處吸光度值，計算每克濕肺中伊文藍含量，以此反映肺血管通透性。

1.3.4 小鼠肺組織病理學變化觀察

取各組小鼠右肺上葉組織，10%甲醛固定24 h后，75%乙醇浸泡24 h，石蠟包埋，切片（4 μm）后保存備用，行蘇木素-伊紅（htoxylin eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.3.5 小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達量檢測

制備1∶9肺組織勻漿，離心后收集上清液，采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELLSA），嚴格按照試劑盒說明書進行檢測各組小鼠肺組織上清液中IL-1β、TNF-α表達量。

1.3.6 小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 mRNA 水平檢測

采用RNA提取試劑盒提取右肺組織總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度及純度（OD/OD=1.7～2.0），反轉錄得到cDNA，置于-20 ℃保存備用。采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法對ERK、p38、NLRP3 mRNA 部分片段進行擴增。ERK、p38、NLRP3 及內參GAPDH 引物序列見表1，反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL ，cDNA（50 ng/μL）2.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddHO 6.0 μL。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環。采用2法定量分析其相對表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.7 小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 蛋白表達量檢測

采用蛋白抽提試劑盒提取各組小鼠右肺組織總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80 ℃保存備用。 取50 g 蛋白樣品，進行SDS-PAGE 電泳，PVDF 膜轉膜，室溫封閉，添加一抗anti-ERK1/2（稀釋比1∶10 000）、anti-p38（稀釋比1∶5 000）、anti-pp38（稀釋比1∶1 000）、anti-NLRP3（1∶1 000）、anti-GAPDH 抗體（1∶2 500）4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜，添加二抗IgG（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜，顯色，曝片，觀察并分析靶蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理結構變化

對照組小鼠肺泡結構完整，無明顯病理改變。模型組小鼠肺泡結構破壞，肺泡腔充滿滲出物，肺泡間隔增厚，毛細血管明顯擴張，肺間質出現大量炎性細胞。紫草素低、中、高濃度組及頭孢呋辛酯組小鼠肺泡結構破壞融合，滲出物減少，炎性細胞浸潤減少，紅細胞數量減少。見圖1。

2.2 各組小鼠W/D 比值及肺血管通透性水平比較

與對照組比較，模型組小鼠W/D 比值及肺血管通透性顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠W/D 比值及肺血管通透性依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠濕重/干重（W/D）比值及肺血管通透性水平比較/± s

2.3 各組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達量比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達量顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠肺組織IL-1β、TNF-α 表達量依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠肺組織白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達量比較/（n=6，± s）

2.4 各組小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 mRNA 水平比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織ERK1、ERK2、p38、NLRP3 mRNA 表達水平均顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠肺組織ERK1、ERK2、p38、NLRP3 mRNA 表達水平依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見表4。

表4 各組小鼠肺組織細胞外信號調節激酶（ERK）、p38絲裂素活化蛋白激酶（p38）、核苷酸結合寡聚化結構域樣蛋白3（NLRP3）mRNA表達水平比較/（n=6，± s）

2.5 各組小鼠肺組織ERK、p38 及其磷酸化蛋白、NLRP3蛋白表達量比較

與對照組比較，模型組小鼠肺組織p-ERK/ERK、p-p38/p38、NLRP3 蛋白表達量均顯著增加（

P

<0.05）；與模型組比較，紫草素低、中、高濃度組小鼠肺組織p-ERK/ERK、p-p38/p38、NLRP3 蛋白表達量依次降低，且紫草素高濃度組低于頭孢呋辛酯組（

P

<0.05）。見圖2、表5。

圖2 WB檢測小鼠肺組織ERK、p38及其磷酸化蛋白、NLRP3蛋白表達

表5 各組小鼠肺組織細胞外信號調節激酶（ERK）、p38絲裂素活化蛋白激酶（p38）、核苷酸結合寡聚化結構域樣蛋白3（NLRP3）蛋白表達水平比較/（n=6，± s）

3 討論

肺炎鏈球菌性肺炎是臨床常見呼吸系統疾病，嚴重時可并發呼吸衰竭、心力衰竭等嚴重感染性并發癥，是導致5 歲以下兒童死亡的首要原因。由于耐藥菌株的出現對抗生素治療效果存在極大限制，因此探究治療肺炎鏈球菌性肺炎的新藥及探究其治病機制具有重要意義。機體感染肺炎鏈球菌后可導致巨噬細胞活化，產生大量促炎因子，例如IL-1β、TNF-α 等，肺內炎性遞質和炎癥因子的釋放和聚集可導致肺損傷。本研究結果發現，與對照組比較，模型組小鼠肺泡結構破壞，肺泡腔充滿滲出物，肺泡間隔增厚，毛細血管明顯擴張，肺間質出現大量炎性細胞，且肺組織IL-1β、TNF-α 表達量顯著增加，提示肺部出現損傷、炎癥反應明顯，肺炎鏈球菌致肺炎小鼠模型制備成功。肺組織血管通透性升高亦是肺器官功能受損的重要特征，而肺部炎癥反應可破壞肺組織，增加肺組織通透性。郭曉夏、安友仲研究報道，降低肺微血管內皮屏障通透性可減輕脂多糖誘導的肺損傷。本研究結果發現，與對照組比較，模型組小鼠肺組織W/D 比值、肺組織血管通透性顯著增加，提示肺炎鏈球菌感染可導致小鼠肺組織損傷，肺血管通透性增加。紫草素是從天然藥物紫草中提取的萘醌類化合物，具有良好的抗炎、抗菌效果。Zhang 等研究報道，紫草素可抑制MAPK-核因子κB 信號通路，減輕脂多糖誘導的急性肺損傷。Zhao 等研究報道，紫草素可減輕肺炎球菌溶氣素的生物毒性，降低肺炎小鼠的死亡率，減輕肺組織損傷。本研究結果發現，紫草素可呈劑量依賴性降低肺組織W/D 比值、肺血管通透性及肺組織IL-1β、TNF-α 表達量，且高劑量效果優于陽性藥物頭孢呋辛酯，提示紫草素可能對肺炎鏈球菌性肺炎小鼠具有一定治療作用，可減輕肺血管通透性及肺組織炎癥反應，減輕肺損傷。

MAPK 可分為ERK、p38、JNK 和ERK5 4 個亞族，在細胞內分布廣泛，ERK 主要有ERK1、ERK2 兩種，可參與多種炎性蛋白基因的表達調節，是肺組織慢性炎癥及氣道炎癥反應重要調控因子。NLRP3炎癥小體復合體由NLRP3、接頭蛋白（ASC）及半胱天冬酶-1（caspase-1）前體組成，NLRP3 激活會誘導促炎蛋白酶caspase-1激活，繼而剪切IL-1β、TNF-α、IL-18等炎性因子并促進其激活釋放至胞外，調節機體多種疾病中免疫應答及炎癥反應。 IL-1β、TNF-α 等多種因子刺激后可使p38 發生磷酸化，誘導p38 通路激活，發揮促炎作用。Zhou 等研究報道，抑制ERK 和p38信號通路可減少膿毒癥大鼠IL-1β、TNF-α 因子釋放，進而NLRP3/caspase-1 通路誘導的內皮細胞焦亡。Wang等研究報道，紫草素可通過抑制ERK-核因子κB通路減輕小鼠過敏性氣道重塑。Wang 等研究報道，紫草素可通過抑 制ERK1/2 磷酸化抑制ERK 信號通路抑制肺癌細胞侵襲轉移。本研究結果發現，與對照組比較，模型組小鼠肺組織ERK、p38、NLRP3 mRNA 及蛋白表達水平均顯著增加，提示肺炎鏈球菌感染可促使ERK、p38、NLRP3 信號通路激活。而紫草素可呈劑量依賴性降低ERK、p38、NLRP3 mRNA 及蛋白表達水平，且高劑量效果優于陽性藥物頭孢呋辛酯，提示紫草素減輕肺炎鏈球菌性大鼠肺損傷及炎癥反應、降低肺血管通透性，可能與抑制ERK、p38、NLRP3信號通路有關。

綜上所述，紫草素可降低肺炎鏈球菌性肺炎小鼠肺損傷及炎癥反應、降低肺血管通透性，可能與抑制ERK、p38、NLRP3 信號通路有關。但關于紫草素的安全劑量及對ERK、p38、NLRP3 信號通路詳細作用機制有待進一步深入探究。