基于網絡藥理學探討四妙散治療痛風性關節炎的潛在機制

容偉明 袁長深 段 戡 梅其杰 郭錦榮 盧智賢

1.廣西中醫藥大學研究生院，廣西南寧 530000；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院骨三科，廣西南寧 530023

痛風性關節炎是一種代謝性疾病，體內過多的尿酸可在滑液或軟骨中積聚并形成尿酸單鈉晶體，引起關節炎的發生[1]，其是導致疼痛和致殘的主要疾病之一[2]，影響患者的生活質量。隨著人們生活水平的提高，發病率也逐年上升[3]。雖然此病是良性疾病，但仍未得到充分治療。目前多使用非甾體類抗炎藥、秋水仙堿和皮質類固醇激素等對癥治療，療效一般且副作用較大，由于西藥治療的局限性，迫切需要探索中藥治療痛風性關節炎的可行性[4]。

四妙散是由蒼術、黃柏、牛膝、薏苡仁四味中藥組成，在治療急性期的痛風性關節炎中，可獲得較好的臨床效果[5-6]，但其潛在的作用機制尚未清楚。因此，通過網絡藥理學方法，分析四妙散治療痛風性關節炎的關鍵基因和信號通路，為進一步明確四妙散對痛風性關節炎的作用機制奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 有效成分及其作用靶標

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）以“蒼術”“黃柏”“牛膝”“薏苡仁”為檢索詞分別檢索四妙散中四味中藥的化學成分，篩選出同時符合“口服生物利用度（oral bioavailability，OB）>30%”和“類藥 性（drug likeness，DL）>0.18”的化合物，即為中藥的有效成分，并檢索出其作用的靶標。

1.2 基因名的注釋

通過UniProt 數據庫注釋出靶標相對應的基因名，再利用Cytoscape 軟件建立藥物-有效成分-作用靶標網絡。

1.3 疾病相關基因

在GeneCards 和OMIM 數據庫中以“gouty arthritis”為檢索詞篩選出與痛風性關節炎相關的基因。

1.4 復方直接作用的靶基因

將篩出的四妙散作用靶標和痛風性關節炎相關基因進行交集，相交的結果即為四妙散治療痛風性關節炎的直接靶基因。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

將靶基因導入Enrichr 數據庫進行GO 和KEGG途徑富集分析，其中GO 包括生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）；再利用R 軟件繪制富集分析的氣泡圖。

1.6 關鍵基因

使用STRING 數據庫構建靶基因交互系數為0.4的蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡，再通過Cytoscape 軟件中“cytohubba”插件進行網絡拓撲分析篩選出關鍵基因。

1.7 藥物-基因-通路網絡構建

為了更直觀地了解四妙散治療痛風性關節炎的關鍵基因和重要途徑，通過Cytoscape 構建藥物-基因-通路網絡圖。

2 結果

2.1 有效成分

通過TCMSP 得到四妙散中65 個獨立的有效成分，其中蒼術9 個、黃柏37 個、牛膝20 個、薏苡仁9 個；有靶標的有效成分是40 個。

2.2 有效成分-靶標關系網絡

40 個有效成分可作用的靶標共有197 個（圖1），通過網絡拓撲分析顯示，有效成分較為重要的是槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和漢黃芩素（wogonin），被作用最多的靶標是PTGS2、PTGS1 和NCOA2。

圖1 藥物-有效成分-作用靶標圖

2.3 復方直接作用的靶基因

與痛風性關節炎相關的獨立基因215 個，再與四味藥作用靶標交集得到27 個靶基因（圖2），其中四味藥物與疾病相關共有的基因3 個，三味藥物與疾病相關的基因10 個，兩味藥物與疾病相關的基因13 個，一味藥物與疾病相關的基因1 個。

圖2 藥物作用靶標與疾病基因交集

2.4 富集分析

利用Enrichr 數據庫分析27 個靶基因，在P ＜0.05條件下，得到622 個GO 條目，其中BP 有551 個、MF有63 個和CC 有8 個，KEGG 途徑分析共有109 條信號通路。根據P 值選出BP、MF 前10 個顯著通路和KEGG 前30 條較為顯著的信號通路。BP 結果顯示靶基因顯著富集于細胞對細胞因子刺激的反應和細胞因子介導的信號通路；MF 揭示靶基因在細胞因子活性和趨化因子活性中顯著富集；CC 顯示靶基因在富含ficolin-1 的顆粒內腔和富含ficolin-1 的顆粒中較為豐富（圖3A～C，見封三）。KEGG 途徑富集分析結果顯示，靶基因在IL-17 信號通路、TNF 信號通路顯著富集（圖3D，見封三）。

圖3 GO 與KEGG 富集的氣泡圖

2.5 關鍵基因

靶基因的PPI 網絡包括27 個節點和171 條關系邊數，再根據Degree 得分篩選出前10 位較為重要的基因，包括CXCL8、IL-6、PTGS2、CCL2、IL-1B、PPARG、IL-10、MMP9、MAPK1 和MMP2（圖4）；再結合藥物作用靶點與疾病相關基因的交集，可發現PTGS2、PPARG、CCL2、IL-6、CXCL8 等是四妙散治療痛風性關節炎的關鍵基因。

圖4 靶基因蛋白質-蛋白質相互作用網絡

2.6 有效成分-基因-通路網絡

構建有效成分-基因-通路網絡，如圖5（見封四）所示，淺藍色圓圈代表關鍵基因，深藍色圓圈代表剩下的靶基因，紫色倒三角代表主要有效成分，綠色倒三角代表另外的有效成分，紅色正方形代表重要的信號通路。

圖5 有效成分-基因-通路網絡

3 討論

痛風性關節炎屬中醫的“痹癥”“歷節”“風痹”等范疇。大部分學者認為濕、熱、瘀三者的相互作用主導著痛風性關節炎的發展[7-8]，治療以清熱祛濕、祛瘀止痛為主；而方選四妙散切中其病機[5-6]。

本研究篩選到四妙散中40 個有效成分，其中槲皮素、山柰酚和漢黃芩素較為重要，均屬于黃酮類化合物，其中槲皮素能降低炎癥因子的水平起到抗炎作用[9]，但其不能降低血尿酸的含量[10]。山柰酚則可通過與嘌呤分解代謝中的關鍵酶-黃嘌呤氧化酶競爭性結合，減少尿酸的形成[11]。

為明確四妙散在治療痛風性關節炎過程中主要的生物功能和信號通路，對復方可直接作用的靶基因進行富集分析及篩選發現其主要富集在細胞對細胞因子刺激的反應、細胞因子介導的信號通路等生物學過程中和IL-17、TNF 信號通路中。研究發現，在痛風性關節炎患者血液中多種細胞因子的差異表達[12]，這可能是沉積的尿酸單晶體觸發促炎性細胞因子IL-1β的釋放，進而引起其他細胞因子的反應導致痛風性關節炎的發生[13]，因此通過降低IL-1β 的表達可明顯減輕炎癥反應[14]。IL-17 信號通路主要是通過內在的NF-κB 和MAPK通路來調節細胞中炎癥基因的表達進而控制炎癥[15]。IL-17 作為關鍵炎癥細胞因子，在急性痛風性患者血清中呈高表達[16]，降低其含量可消腫和減少白細胞的浸潤，因此阻斷IL-17 信號通路是治療痛風性關節炎的一種新策略[17]。TNF 信號通路是在TNF-α 刺激下引起的途徑，其可激活NF-κB 并進一步促使炎癥的發生[18]。

最后分析可知PTGS2、PPARG、CCL2、IL-6、CXCL8等是四妙散治療痛風性關節炎的關鍵基因。PTGS2（即COX-2）在調節炎癥和緩解疼痛中發揮重要作用，是非甾體抗炎藥的治療目標[19]，其在急性痛風性關節炎中呈高表達，阻滯其表達可有效抑制炎癥的發生[20]。PPARG 是由PPARγ 編碼的基因，其可降低痛風性關節炎滑膜中TNF-α 和IFN-γ 的表達而減輕炎癥反應[21]。CCL2、IL-6 和CXCL8（即IL-8）是引起炎癥反應重要因子；外周血中CCL2 的甲基化不足是導致痛風的危險因素之一[22]，同時血清中IL-6、IL-8 及其他細胞因子在痛風性關節炎發展中發揮重要作用[23]。

本研究是通過網絡藥理學的方法，挖掘四妙散治療痛風性關節炎可能的靶基因及信號通路，為進一步研究四妙散治療痛風性關節炎提供理論依據，但其可能性仍需更多的實驗加以驗證。