西紅花酸對(duì)阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響

韓笑，王攀，劉建勛，陶夏莉，任鈞國(guó)，付建華，許勇剛

西紅花酸對(duì)阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響

韓笑1，王攀1，劉建勛1，陶夏莉2，任鈞國(guó)1，付建華1，許勇剛1

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京市中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091； 2.北京瑞諾眾德科技有限公司，北京 100089

觀察西紅花酸對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷的影響，從線粒體角度探討其作用機(jī)制。培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞，阿霉素誘導(dǎo)建立心肌細(xì)胞損傷模型。細(xì)胞分為正常組、模型組（阿霉素10 μmol/L）、西紅花酸高劑量組（阿霉素10 μmol/L＋西紅花酸20 μmol/L）、西紅花酸低劑量組（阿霉素10 μmol/L＋西紅花酸10 μmol/L），給藥6 h后CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)Caspase-8蛋白表達(dá)。與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞存活率降低（＜0.01），細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高（＜0.001），線粒體膜電位降低（＜0.001），細(xì)胞凋亡率升高（＜0.001），cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高，cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低（＜0.001），Caspase-8蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.01，＜0.05），ROS水平顯著降低（＜0.001），線粒體膜電位升高（＜0.001），細(xì)胞凋亡率降低（＜0.01），cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)降低，cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值降低（＜0.001，＜0.05），Caspase-8蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.001），西紅花酸高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2/Bax比值顯著升高（＜0.01）。西紅花酸可保護(hù)阿霉素致心肌細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與保護(hù)線粒體、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。

西紅花酸；阿霉素；線粒體；凋亡；心肌細(xì)胞；大鼠

阿霉素是臨床廣泛使用的抗癌抗生素，但其毒副作用使腫瘤患者心臟病的發(fā)病率和病死率增加，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量和遠(yuǎn)期存活[1]。氧自由基的生成和線粒體氧化應(yīng)激損傷是阿霉素導(dǎo)致心臟毒性的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[2-3]，細(xì)胞凋亡在阿霉素心肌病的發(fā)病過(guò)程中也起到關(guān)鍵作用[4]。西紅花苷片臨床用于治療心血管疾病。由于西紅花苷相對(duì)分子質(zhì)量大，極性強(qiáng)，口服不能以原型藥物透過(guò)腸道屏障，需經(jīng)腸道酶或細(xì)菌酶作用，水解成苷元西紅花酸后方可吸收入血。西紅花酸可能是西紅花苷的體內(nèi)活性分子[5-7]。目前西紅花酸在保護(hù)阿霉素致心肌損傷方面研究較少，致使西紅花苷片（西紅花酸）治療或輔助治療阿霉素心肌病缺乏有效的證據(jù)支持。因此，本研究采用阿霉素誘導(dǎo)建立大鼠心肌細(xì)胞損傷模型，從保護(hù)線粒體、抑制凋亡角度探討西紅花苷體內(nèi)活性成分西紅花酸對(duì)阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞和藥物

H9c2大鼠心肌細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；注射用阿霉素，10 mg/支，批號(hào)1905E1，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司；西紅花酸，純度98.0%，貨號(hào)27876-94-4，美國(guó)MCE；注射用右丙亞胺，250 mg/支，批號(hào)E2005012，江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco，批號(hào)8120234），胎牛血清（美國(guó)Gibco，批號(hào)2039230），胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20191220），PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20200903），CCK-8試劑盒（日本Dojindo，批號(hào)SA618），Quick Start Bovine Serum Albumin Standard（美國(guó)Bio-Rad，貨號(hào)500-0206），活性氧檢測(cè)試劑盒（上海碧云天，貨號(hào)041720200803），線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（上海碧云天，貨號(hào)C2006），YF?488 Click-iT EdU Flow Cytometry Assay Kits（蘇州宇恒，貨號(hào)Y600），PAGE凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)034A3300），10×電泳緩沖液（北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)HX1896），10×封閉洗滌液（北京華興博創(chuàng)基因技術(shù)有限公司，貨號(hào)HX1893），增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（美國(guó)Thermo Scientific，貨號(hào)34096），兔抗Caspase-3抗體（英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab13847），兔抗Bax抗體（英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab32503），兔抗Bcl-2抗體（英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab194583），兔抗Caspase-8抗體（英國(guó)Abcam，貨號(hào)ab25901），兔抗β-actin抗體（美國(guó)Affinity Biosciences，貨號(hào)AF7018），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京源博匯科生物技術(shù)研究所，批號(hào)127760），Hoechst33342染色液（北京索萊寶，批號(hào)20190509），F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗兔IgG（北京源博匯科生物技術(shù)研究所，批號(hào)138768）。生物安全柜（蘇凈集團(tuán)安泰公司，BHC-1300ⅡA/B3），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo，371），倒置顯微鏡（日本Olympus，IX51），熒光顯微鏡（日本Olympus，IX81），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek，Synergy 4），冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo，IEC CL31R），電泳儀（美國(guó)Bio-Rad，Power Pac Univeral），凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad，ChemiDoc XRS+）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

液氮中快速取出H9c2細(xì)胞，37 ℃水浴中迅速融化，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至離心管，加入5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，細(xì)胞沉淀以5 mL培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，待細(xì)胞融合達(dá)85%時(shí)，胰蛋白酶消化傳代。細(xì)胞穩(wěn)定2～3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組及給藥

將H9c2細(xì)胞分為正常組、模型組、西紅花酸高劑量組、西紅花酸低劑量組。模型組H9c2細(xì)胞用含10 μmol/L阿霉素的DMEM培養(yǎng)基處理6 h，西紅花酸高劑量組用含10 μmol/L阿霉素和20 μmol/L西紅花酸的DMEM培養(yǎng)基處理6 h，西紅花酸低劑量組用含10 μmol/L阿霉素和10 μmol/L西紅花酸的DMEM培養(yǎng)基處理6 h，正常組用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，6 h后取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

2.3 細(xì)胞存活率檢測(cè)

取生長(zhǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞，按各組給藥方案處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育3 h，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）＝實(shí)驗(yàn)組OD值÷正常組OD值×100%。

2.4 活性氧水平檢測(cè)

取生長(zhǎng)于共聚焦培養(yǎng)皿的H9c2細(xì)胞，按各組給藥方案處理后，采用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞1次，加入1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA ROS探針（1∶1 000），放回培養(yǎng)箱孵育20 min，無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3次，去除多余的ROS探針，加入1 mL無(wú)血清培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，Image J軟件分析ROS平均熒光強(qiáng)度。

2.5 線粒體膜電位檢測(cè)

取接種于共聚焦培養(yǎng)皿的H9c2細(xì)胞，按各組給藥方案處理后，采用JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作，吸棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基和1 mL JC-1染色工作液，混勻后放回培養(yǎng)箱孵育20 min，吸除上清液，以JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光和綠色熒光，每組3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，Image J軟件分析紅綠熒光強(qiáng)度，以紅綠熒光比值表示線粒體膜電位。

2.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

取生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶中的H9c2細(xì)胞，經(jīng)分組給藥方案處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。胰蛋白酶消化細(xì)胞，4 ℃、300×離心5 min，收集5×105個(gè)細(xì)胞，用100 μL結(jié)合緩沖液重懸，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至測(cè)定管，每管加入4 μL YF?488-Annexin V和4 μL PI工作液，室溫避光孵育15 min，每管加入400 μL PBS，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 Western blot檢測(cè)

取生長(zhǎng)于培養(yǎng)瓶中的H9c2細(xì)胞，按分組給藥方案處理后，預(yù)冷PBS洗滌3次，RIPA裂解液裂解30 min，離心取上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度；取等量蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h，加入Caspase-3、Bcl-2、Bax（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗膜3次，每次10 min；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶50 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑顯色，Bio-Rad凝膠成像儀顯影，系統(tǒng)成像軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

2.8 免疫熒光檢測(cè)

取生長(zhǎng)于共聚焦培養(yǎng)皿的H9c2細(xì)胞，按分組給藥方案處理后，吸除舊培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，預(yù)冷的4%多聚甲醛冰上固定細(xì)胞15 min，PBS洗滌3次，每次1 min；0.1%Triton X-100處理細(xì)胞10 min，PBS清洗3次，每次1 min；山羊血清室溫封閉1 h，加入Caspase-8（1∶50）抗體，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS清洗3次，每次3 min；加入FITC標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶200）室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次3 min；Hoechst33342染色液室溫孵育3 min，PBS清洗3次，每次1 min；加1 mL PBS，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每組3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，Image J軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 西紅花酸對(duì)模型細(xì)胞存活率的影響

與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細(xì)胞存活率明顯升高（＜0.01，＜0.05），西紅花酸高、低劑量組細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組H9c2細(xì)胞存活率比較（±s）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

4.2 西紅花酸對(duì)模型細(xì)胞活性氧水平的影響

與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞ROS水平明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細(xì)胞ROS水平明顯降低（＜0.001）；西紅花酸高劑量組ROS水平顯著低于西紅花酸低劑量組（＜0.001）。見(jiàn)圖1。

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001；與西紅花酸低劑量組比較，▲▲▲P＜0.001

4.3 西紅花酸對(duì)模型細(xì)胞線粒體膜電位的影響

正常組H9c2細(xì)胞JC-1以聚合物形式存在于線粒體中，呈紅色熒光，綠色熒光微弱，紅綠熒光比值較高，提示線粒體膜電位較高；模型組H9c2細(xì)胞JC-1以單體形式散在于胞漿中，呈綠色熒光，紅色熒光強(qiáng)度降低。與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞線粒體膜電位明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細(xì)胞線粒體膜電位有所升高（＜0.001），其中，西紅花酸高劑量組線粒體膜電位明顯高于西紅花酸低劑量組（＜0.001），見(jiàn)圖2。

4.4 西紅花酸對(duì)模型細(xì)胞凋亡率的影響

與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞凋亡率明顯升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細(xì)胞凋率顯著降低（＜0.01），西紅花酸高、低劑量組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見(jiàn)圖3。

4.5 西紅花酸對(duì)模型細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)升高，cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值升高（＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值明顯降低（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細(xì)胞cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值明顯降低（＜0.001，＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax蛋白表達(dá)降低，其中，西紅花酸高劑量組Bcl-2/Bax比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。西紅花酸高劑量組作用優(yōu)于西紅花酸低劑量組（＜0.05），見(jiàn)圖4、圖5。

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，**P＜0.01

注：A.正常組；B.模型組；C.西紅花酸高劑量組；D.西紅花酸低劑量組

注：與正常組比較，##P＜0.01，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與西紅花酸低劑量組比較，▲P＜0.05

4.6 西紅花酸對(duì)模型細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，西紅花酸高、低劑量組H9c2細(xì)胞Caspase-8蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.001）。見(jiàn)圖6、圖7。

圖6 各組H9c2細(xì)胞Caspase-8蛋白陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

注：與正常組比較，###P＜0.001；與模型組比較，***P＜0.001；與西紅花酸低劑量組比較，▲▲▲P＜0.001

5 討論

西紅花具有活血化瘀、通脈止痛功效，臨床主要用于冠心病心絞痛心血瘀阻證的治療。藥理研究表明，西紅花苷具有降血壓[8]、降血脂[9]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[10]、抗心肌缺血[11]、抗心肌缺血再灌注損傷[12]、抗血小板聚集[13]等作用；此外，其有抗腫瘤活性[14]，能抑制多種惡性和非惡性腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[15]。

化療藥物以阿霉素類藥品對(duì)心肌破壞最為顯著，對(duì)心肌器質(zhì)性損害從第一次應(yīng)用就可能出現(xiàn)[16]，并呈進(jìn)行性加重，且不可逆轉(zhuǎn)[17]。西紅花苷是否可用于治療或輔助治療阿霉素心肌病，成為有效改善阿霉素心臟毒性的藥物，尚需更多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的支持。

由于口服西紅花苷需水解成西紅花酸后才能吸收進(jìn)入血液循環(huán)而發(fā)揮藥理作用[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)以西紅花酸為研究對(duì)象，觀察其對(duì)阿霉素致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并初步探討其作用機(jī)制。

心肌細(xì)胞富含線粒體，阿霉素對(duì)心磷脂具有較高的親和力，可進(jìn)入線粒體，結(jié)合心磷脂從而抑制呼吸鏈，造成心臟損傷[18]。此外，線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，同時(shí)也是ROS作用最敏感的靶點(diǎn)部位，ROS通化氧化線粒體心磷脂、線粒體DNA和線粒體重要的蛋白質(zhì)對(duì)線粒體造成氧化損傷，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位降低，ATP生成不足及細(xì)胞色素C等促凋亡因子過(guò)量釋放，進(jìn)而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與此同時(shí)，受損的線粒體又可產(chǎn)生更多的ROS。ROS與線粒體氧化損傷互為因果，惡性循環(huán)，共同參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。

Bcl-2和Bax是凋亡的重要調(diào)控基因，其中Bax是促凋亡基因，在死亡信號(hào)刺激下轉(zhuǎn)位至線粒體膜上，致使線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，釋放細(xì)胞色素C等促凋亡因子[20]，進(jìn)而啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中啟動(dòng)型Caspase-8首先被活化，啟動(dòng)凋亡并調(diào)節(jié)效應(yīng)型Caspase-3，分解細(xì)胞蛋白，執(zhí)行凋亡[21]。Bcl-2是抑凋亡基因，超表達(dá)的Bcl-2蛋白可與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的轉(zhuǎn)位及二聚體化，關(guān)閉線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道，抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制凋亡發(fā)生[20]。可見(jiàn)，Bcl-2/Bax比值決定細(xì)胞凋亡發(fā)生與否[22]。Bcl-2/Bax比值下降，預(yù)示線粒體通透性增加，線粒體膜電位降低，大量促凋亡因子釋放，活化Caspase-8進(jìn)而啟動(dòng)Caspase-3，細(xì)胞趨于凋亡；反之，Bcl-2/Bax比值增加，細(xì)胞趨于存活。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素處理后，H9c2細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示阿霉素可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡，損傷心肌細(xì)胞。給予高、低劑量西紅花酸處理后，H9c2細(xì)胞ROS水平降低，線粒體膜電位升高，Bcl-2/Bax比值升高，Caspase-8表達(dá)降低，Caspase-3活化降低（cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值降低），細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞存活率升高。提示西紅花酸可保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，一方面通過(guò)抑制受損線粒體產(chǎn)生過(guò)多的ROS，減輕ROS對(duì)線粒體的氧化損傷和結(jié)構(gòu)破壞；另一方面通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，維持Bcl-2/Bax平衡，二者共同保護(hù)和維持線粒體結(jié)構(gòu)，降低線粒體通透性，維持線粒體膜電位，抑制促凋亡因子過(guò)量釋放，從而減少或抑制啟動(dòng)型Caspase-8的活化，進(jìn)而減少Caspase-8對(duì)主要靶點(diǎn)pro-Caspase-3的活化剪切，抑制凋亡的發(fā)生，保護(hù)受損心肌細(xì)胞，最終體現(xiàn)為細(xì)胞凋亡率降低和細(xì)胞存活率升高。

綜上所述，西紅花酸對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與保護(hù)線粒體、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。

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Effects of Crocetin on Adriamycin-induced Cardiomyocyte Injury in Rats

HAN Xiao1, WANG Pan1, LIU Jianxun1, TAO Xiali2, REN Junguo1, FU Jianhua1, XU Yonggang1

To observe the effects of crocetin on adriamycin-induced cardiomyocyte injury in rats; To discuss its mechanism from the perspective of mitochondria.H9c2 (rat cardiomyocytes) were cultured and stimulated by adriamycin to make cardiomyocyte damage. The experiment was divided into normal group, model group (adriamycin 10 μmol/L), crocetin high-dosage group (adriamycin 10 μmol/L + crocetin 20 μmol/L), and crocetin low-dosage group (adriamycin 10 μmol/L + crocetin 10 μmol/L). After 6 hours of treatment, CCK-8 method was used to detect the cell survival rate; DCFH-DA was used to detect intracelluar ROS level; JC-1 fluorescent probe was used to detect mitochondrial membrane potential; flow cytometry was used to detect apoptosis rate; Western blot was used to detect the protein expressions of Caspase-3, Bcl-2 and Bax; immunofluorescence was used to detect the expression of Caspase-8.Compared with the normal group, the survival rate of the model group decreased (<0.01), the level of intracelluar ROS increased (<0.001), the mitochondrial membrane potential decreased (<0.001), the apoptosis rate increased (<0.001), the expressions of cleaved Caspase-3 and cleaved Caspase-3/pro Caspase-3 increased (<0.01), the expression of Bcl-2 decreased, the expression of Bax increased, the ratio of Bcl-2/Bax decreased significantly (<0.001), and the expression of Caspase-8 increased (<0.001). Compared with the model group, crocetin high- and low-dosage groups significantly increased cell survival rate (<0.01,<0.05), decreased intracellular ROS level (<0.001), increased mitochondrial membrane potential (<0.001), and decreased apoptosis rate (<0.01). The protein expression of cleaved Caspase-3 decreased and cleaved Caspase-3/pro Caspase-3 significantly decreased (<0.001,<0.05), and Caspase-8 protein expression was significantly reduced (<0.001). The expressions of Bcl-2 increased and Bax decreased in crocetin high-dosage group, and the ratio of Bcl-2/Bax significantly increased (<0.01).Crocetin can protect adriamycin-induced cardiomyocyte injury, and its mechanism may be related to the protection of mitochondria and inhibition of cell apoptosis.

crocetin; adriamycin; mitochondrion; apoptosis; cardiomyocyte; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0064-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202102347

國(guó)家科技重大專項(xiàng)－重大新藥創(chuàng)制（2017ZX09301018）

任鈞國(guó)，E-mail：reek2003@yahoo.com.cn

（收稿日期：2021-02-25）

（修回日期：2021-03-29；編輯：華強(qiáng)）