基于ROS/NLRP3/Caspase-1通路的鹿芪方對慢性心力衰竭小鼠心肌細胞焦亡的影響

2021-11-01 07:39:58張曉青瞿惠燕趙丹丹楊曉利蘭真真楊濤周華

中國中醫藥信息雜志 2021年10期

張曉青，瞿惠燕，趙丹丹，楊曉利，蘭真真，楊濤，周華

張曉青，瞿惠燕，趙丹丹，楊曉利，蘭真真，楊濤，周華

上海中醫藥大學附屬曙光醫院，上海中醫藥大學附屬曙光醫院心血管研究所，上海 201203

觀察鹿芪方對慢性心力衰竭小鼠心肌細胞焦亡的影響，從ROS/NLRP3/Caspase-1通路探討其作用機制。60只C57BL/6J小鼠隨機分為假手術組、模型組、鹿芪方組、培哚普利組，采用冠狀動脈前降支結扎法制備慢性心力衰竭小鼠模型。鹿芪方組和培哚普利組分別予相應藥液灌胃，假手術組和模型組予等量生理鹽水灌胃，連續6周。超聲檢測小鼠心功能，HE染色、Masson染色檢測小鼠心肌組織病理變化和膠原纖維沉積，DHE熒光探針檢測心肌組織活性氧（ROS）含量，Western blot檢測心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達，免疫組化檢測白細胞介素（IL）-1β表達，透射電鏡觀察心肌組織超微結構。與假手術組比較，模型組小鼠左室射血分數（LVEF）和左室收縮分數（LVFS）降低，左室舒張末期內徑（LVIDd）與左室收縮末期內徑（LVIDs）升高；心肌細胞明顯增大，排列不規則，有較多炎性細胞聚集及膠原纖維沉積；心肌組織ROS含量增加，NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及IL-1β表達升高，差異均有統計學意義（＜0.01）。與模型組比較，鹿芪方組與培哚普利組小鼠LVEF和LVFS升高，LVIDd和LVIDs降低；心肌細胞損傷改善，膠原纖維沉積明顯減少，心肌纖維化明顯減輕；心肌組織ROS含量減少，NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及IL-1β表達降低，差異均有統計學意義（＜0.01）。鹿芪方能有效減輕慢性心力衰竭小鼠心肌細胞焦亡，其機制可能與抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路活化，減輕心肌炎癥反應相關。

鹿芪方；活性氧；NLRP3；炎性小體；心力衰竭；小鼠

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）因其較高的發病率和死亡率，始終是心血管疾病研究領域的熱點與難點[1-2]。細胞焦亡是由Caspase-1介導的程序性細胞死亡，不同于細胞凋亡、壞死，細胞焦亡時細胞內容物釋放，引起強烈的炎癥反應，因此又稱細胞炎性壞死[3]。心肌梗死后，早期的炎癥反應對清除壞死的細胞和組織碎片至關重要，但過度的炎癥反應會加劇心肌梗死后的炎癥級聯反應，不利于瘢痕組織愈合，最終導致心力衰竭[4]。研究表明，在心力衰竭患者心肌組織中，NLRP3、Caspase-1等焦亡關鍵蛋白表達升高[5-6]。Han等[7]通過缺氧心肌細胞模型發現，長鏈非編碼RNA H19過表達可抑制NLRP3、Caspase-1表達，減輕心肌細胞焦亡。因此，抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路活化，減少心肌細胞焦亡可能是治療心力衰竭的有效方法之一。

鹿芪方為周華教授治療CHF的經驗方，具有益氣溫陽、活血利水功效。課題組前期研究發現，鹿芪方可促進心肌細胞自噬，改善心肌能量代謝，增強心肌細胞抗凋亡能力[8-9]。基于此，本實驗基于ROS/ NLRP3/Caspase-1信號通路觀察鹿芪方對CHF小鼠心肌細胞焦亡的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠60只，8周齡，體質量（20±2）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號SYXK（滬）2020-0009，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房，自由攝食飲水。實驗方案經上海中醫藥大學實驗研究倫理委員會批準（PZSHUTCM200807012）。動物飼養及處理過程嚴格按照《實驗動物管理和使用指南》[10]進行。

1.2 藥物及制備

鹿芪方（鹿角片9 g，紅花9 g，黃芪30 g，黨參30 g，桂枝9 g，葶藶子20 g），飲片由上海中醫藥大學附屬曙光醫院中藥房提供，并制成中藥免煎顆粒，使用時配制成68 mg/mL混懸液。培哚普利片，施維雅（天津）制藥有限公司，批號2017106，配制成濃度為60.7 μg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

HE染色試劑盒（上游碧云天科技有限公司，貨號C0105S），Masson染色試劑盒（安徽雷根生物，貨號DC0032），異氟烷（上海玉研科學儀器有限公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（賽默飛生物，貨號P0012），兔抗小鼠NLRP3抗體（美國CST，貨號15101S），ASC抗體（美國CST，貨號67824S），Caspase-1抗體（英國Abcam，貨號ab179515），白細胞介素（IL）-1β抗體（美國Santa Cruz，貨號sc-12742），GAPDH抗體（美國Bioworld，貨號AP0066），HRP標記山羊抗兔IgG（美國CST，貨號7074），ECL發光液（上海天能，貨號180-501）。彩色多普勒超聲診斷系統（美國GE，VIVID5），多功能酶標儀（美國BioTek，Cytation 3），倒置顯微鏡（日本Nikon，Eclipse Ts2R），垂直式蛋白電泳槽（美國Bio-Rad，165-8004），濕轉膜儀（美國Bio-Rad，170-3930），化學發光成像系統（上海天能，4600SF），電泳及轉膜電源儀（美國Bio-Rad，Universal）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

60只小鼠隨機分為假手術組、模型組、鹿芪方組和培哚普利組，每組15只。除假手術組外，其余各組小鼠行冠狀動脈前降支（LAD）結扎術。小鼠氣體麻醉機下麻醉，脫毛劑去除頸前及左胸部毛發，暴露手術區，酒精消毒，于第3、4肋間打開胸腔充分暴露心臟，用直鑷夾起少量心包并于左心耳下撕開少許心包，迅速擠壓出心臟，用7-0帶線縫合針于左心耳下緣2 mm處進針，穿過LAD，以完全阻斷LAD血流。結扎后迅速將心臟復位，并用5-0帶線縫合針縫皮，心電圖ST段抬高表明造模成功。假手術組僅開胸、穿線不結扎。按人與小鼠體表面積換算等效劑量，鹿芪方組和培哚普利組分別予予鹿芪方0.68 g/kg、培哚普利0.607 mg/kg灌胃，假手術組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積0.2 mL，連續6周。

2.2 心功能檢測

小鼠麻醉后，行超聲觀察，計算心臟左室射血分數（LVEF）、左室收縮分數（LVFS）、左室舒張末期內徑（LVIDd）、左室收縮末期內徑（LVIDs）。

2.3 心肌組織病理觀察

取小鼠心肌組織，石蠟包埋后切片（5 μm），梯度乙醇脫蠟，行HE染色，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。另取心肌組織石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，Weigert鐵蘇木素染色10 min；乙酸分化液分化水洗，Masson藍化液返藍，水洗；麗春紅酸性品紅染色液染5 min，弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min；苯胺藍染液復染2 min，弱酸工作液復洗1 min，脫水后中性樹膠封片。光鏡下觀察并拍照，采用圖像分析軟件Image J 1.41進行測定，計算心肌纖維化面積。心肌纖維化面積（%）＝膠原纖維沉積面積÷視野總面積×100%。

2.4 心肌組織活性氧檢測

心肌組織OCT包埋后行冰凍切片（5 μm），4%多聚甲醛室溫固定5 min，純水洗滌3次，每次30 s；DHE工作液室溫染色5～20 min，純水洗滌3次，每次1 min，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。采用Image J 1.41分析熒光強度。ROS陽性率（%）＝紅色熒光細胞數目÷細胞總數×100%。

2.5 Western blot檢測小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達

取20 mg小鼠心肌組織，加入200 μL RIPA裂解液，勻漿機研磨90 s，BCA法測定蛋白濃度，95 ℃煮10 min使蛋白變性；SDS-PAGE后，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；按1∶1 000加入NLRP3、ASC、Caspase-1一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；加入HRP標記二抗，室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；滴加ECL發光液（A液、B液按1∶1混勻），化學發光成像系統曝光，以GAPDH為內參，計算目的蛋白相對表達量。

2.6 免疫組化檢測心肌組織白細胞介素-1β表達

取心肌組織石蠟切片，梯度乙醇脫蠟，檸檬酸鈉抗原修復，去除內源性過氧化物酶；10%BSA室溫封閉1 h，滴加IL-1β（1∶100）一抗，4 ℃孵育過夜；二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素染色30 s，流水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。使用Image J 1.41軟件分析IL-1β表達的平均光密度。

2.7 透射電鏡觀察心肌組織超微結構

心肌組織置于2.5%戊二醛中固定2 h，緩沖液清洗3次，每次10 min；1%鋨酸固定，緩沖液清洗；梯度乙醇脫水，丙酮浸透；包埋液浸透1.5 h，37 ℃包埋12 h，60 ℃包埋48 h；行超薄切片，使用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，透射電子顯微鏡觀察。

3 統計學方法

4 結果

4.1 鹿芪方對模型小鼠心功能的影響

與假手術組比較，模型組小鼠LVEF和LVFS顯著降低，LVIDd和LVIDs顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠LVEF和LVFS顯著升高，LVIDd和LVIDs顯著降低（＜0.01）。結果見圖1。