重樓皂苷Ⅱ對人非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響

游麗嬌，孫芳園，楊小芳，耿歡，雷鳴

重樓皂苷Ⅱ對人非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響

游麗嬌，孫芳園，楊小芳，耿歡，雷鳴

上海中醫藥大學附屬第七人民醫院，上海 200137

觀察重樓皂苷Ⅱ對人非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響，探討其可能的作用機制。不同濃度重樓皂苷Ⅱ作用于A549細胞48 h，CCK-8法檢測細胞存活率；將細胞分為對照組和重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組，JC-10熒光探針檢測線粒體膜電位（MMP），Fluo-4 AM熒光探針檢測細胞內Ca2+水平，DCFH-DA熒光探針檢測細胞內活性氧（ROS）水平，Western blot檢測細胞內Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達。與對照組比較，各濃度重樓皂苷Ⅱ可降低A549細胞存活率，差異均有統計學意義（＜0.01）；重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組A549細胞MMP顯著降低，Ca2+、ROS水平顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，重樓皂苷Ⅱ高劑量組Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達顯著升高，差異均有統計學意義（＜0.05）。重樓皂苷Ⅱ可能通過降低細胞MMP，提高細胞內Ca2+水平，增加細胞內ROS含量，調節凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3表達，促進A549細胞凋亡。

非小細胞肺癌；重樓皂苷Ⅱ；A549細胞；線粒體；凋亡

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%，是全球癌癥死亡的主要原因[1]。早期診斷和治療雖然有效，但由于化學抗癌藥物的毒性和耐藥性，故亟需探索和開發更安全、有效的抗癌藥物[2]。近年來，從中藥中提取天然的抗癌活性成分受到廣泛關注。研究報道，中藥有效成分可通過誘導癌細胞凋亡、改變細胞周期、免疫修飾和抑制炎癥發揮抗癌活性[3-4]。線粒體是傳遞凋亡信號的主要細胞器，細胞凋亡過程中，細胞內Ca2+、活性氧（ROS）水平和線粒體膜電位（MMP）變化是線粒體功能障礙的主要事件[5]。因此，靶向線粒體途徑有望成為抗腫瘤藥物篩選的主要策略。重樓皂苷Ⅱ是從重樓中提取的天然三萜類活性成分，已有研究顯示，多種三萜類化合物可促進癌細胞凋亡[6]。本研究觀察重樓皂苷Ⅱ對人非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和細胞

重樓皂苷Ⅱ，成都普菲德生物公司，純度＞98%，批號76296-72-5。人非小細胞肺癌A549細胞，中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養基（貨號MA0315）、FBS（貨號PWL001）、青鏈霉素（貨號MA0110）、CCK-8細胞存活率檢測試劑盒（貨號MAO218）、JC-10熒光探針（貨號MB6097）、Fluo-4 AM鈣離子熒光探針（貨號MA0196）、DCFH-DA ROS熒光探針（貨號MB4682）、Hoechst 33342染色劑（貨號MB3210）和PBS（貨號MA0015），大連美侖生物；Bax（貨號5023S）、Bcl-2（貨號3498S）、cleaved Caspase-3（貨號9661S）和β-actin（貨號8457S）一抗，美國CST公司。CO2培養箱（美國Thermo Scientific公司），倒置顯微鏡（德國徠卡），超凈工作臺（美國Thermo Scientific公司），純水儀（美國Millipore公司），MQ05267多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司），高內涵細胞分析儀（美國GE），電泳儀和轉膜儀（美國Bio-Rad），Amersham Imager 600蛋白成像儀（美國GE）。

1.3 細胞培養及分組

A549細胞用含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。將細胞分為對照組和重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組，根據細胞存活率檢測結果，選擇細胞存活率為50%（IC50）時的濃度作為中劑量，2倍IC50濃度為高劑量，1/2 IC50濃度為低劑量，每組設5個復孔。

1.4 細胞存活率測定

取對數生長期A549細胞，以5×l03個/孔細胞密度接種于96孔板中培養過夜；分別以終濃度為0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L重樓皂苷Ⅱ處理細胞48 h，另設對照組（有細胞，無藥物干預）和空白孔（無細胞，只加入培養基）；48 h后各孔加入10 μL CCK-8溶液培養1 h，于酶標儀波長450 nm處檢測吸光度（OD值），計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（實驗組OD值－空白孔OD值）÷（對照組OD值－空白孔OD值）×100%。

1.5 線粒體膜電位檢測

將A549細胞按5×103個/孔接種于96孔板中培養過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養48 h；PBS洗滌2次，將JC-10試劑和Hoechst 33342染色液均以1∶200加入PBS中，配制JC-10工作液，每孔加100 μL JC-10工作液，37 ℃培養箱中避光孵育45 min，使用高內涵細胞分析儀分析數據并拍照，以紅綠熒光比值計算MMP。

1.6 Ca2+水平檢測

將A549細胞以5×103個/孔接種于96孔板中培養過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養48 h；PBS洗滌2次，將Fluo-4 AM試劑和Hoechst 33342染色液分別以1∶800、1∶200加入PBS中，配制Fluo-4 AM工作液，每孔加100 μL工作液，37 ℃培養箱中避光孵育45 min，使用高內涵細胞分析儀分析數據并拍照，以綠色熒光強度表示Ca2+水平。

1.7 活性氧水平檢測

將A549細胞以5×103個/孔接種于黑色透底96孔板中培養過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養48 h；PBS洗滌2次，將DCFH-DA試劑和Hoechst 33342染色液分別以1∶1 000、1∶200加入PBS中配制DCFH-DA工作液，每孔加100 μL工作液，37 ℃培養箱中避光孵育45 min，多功能酶標儀于激發波長488 nm、發射波長530 nm處測量各孔OD值，計算ROS含量。

1.8 Western blot檢測

取對數生長期A549細胞，以2×105個/mL密度接種于6孔板中培養過夜，分別用低、中、高劑量重樓皂苷Ⅱ培養48 h；RIPA裂解液冰上裂解，提取總蛋白，BCA法蛋白定量；按照上樣濃度比例加入5×蛋白上樣緩沖液，金屬浴95 ℃、10 min使蛋白變性；經PAGE后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；用一抗稀釋液按1∶1 000比例稀釋Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3一抗，4 ℃孵育過夜；1×TBST洗滌3次，每次10 min；室溫孵育二抗2 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min，ECL成像采集圖像，采用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 重樓皂苷Ⅱ對A549細胞存活率的影響

與對照組比較，各濃度重樓皂苷Ⅱ顯著降低細胞存活率（＜0.01）。重樓皂苷Ⅱ濃度為1 μmol/L時，A549細胞存活率為50%，故選擇1 μmol/L作為中劑量、2 μmol/L作為高劑量、0.5 μmol/L作為低劑量進行后續實驗。結果見圖1。

注：與對照組比較，**P＜0.01，***P＜0.001

2.2 重樓皂苷Ⅱ對A549細胞線粒體膜電位的影響

當MMP正常時，JC-10聚集在線粒體基質中，形成聚合物，產生紅色熒光；當MMP降低時，JC-10從線粒體基質釋放到胞漿中，此時JC-10為單體，產生綠色熒光。結果顯示，對照組紅色熒光較強，表明MMP較高；與對照組比較，重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組紅色熒光減弱，綠色熒光增強，紅綠熒光比值降低，提示MMP下降，差異有統計學意義（＜0.05）。結果見圖2。

注：A.對照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組；D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組；與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

2.3 重樓皂苷Ⅱ對A549細胞Ca2+水平的影響

Fluo-4 AM進入細胞后被酯酶剪切形成Fluo-4，從而滯留在細胞內，Fluo-4可與細胞內的Ca2+結合，產生綠色熒光。結果顯示，對照組綠色熒光較弱，表明Ca2+水平較低。與對照組比較，重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組綠色熒光明顯增強，細胞內Ca2+水平顯著升高，差異有統計學意義（＜0.001）。結果見圖3。

注：A.對照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組； D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組；與對照組比較，***P＜0.001

2.4 重樓皂苷Ⅱ對A549細胞活性氧含量的影響

與對照組比較，重樓皂苷Ⅱ中、高劑量組A549細胞ROS含量明顯增加，差異有統計學意義（＜0.01）。結果見圖4。

注：A.對照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組； D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組；與對照組比較，**P＜0.01

2.5 重樓皂苷Ⅱ對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，重樓皂苷Ⅱ低、中、高劑量組Bcl-2蛋白表達顯著降低，重樓皂苷Ⅱ中、高劑量組Bax蛋白表達顯著升高，重樓皂苷Ⅱ低、高劑量組cleaved Caspase-3蛋白表達顯著升高，差異均有統計學意義（＜0.05，＜0.01）。結果見表1、圖5。

表1 各組A549細胞Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*＜0.05，**＜0.01

注：A.對照組；B.重樓皂苷Ⅱ低劑量組；C.重樓皂苷Ⅱ中劑量組； D.重樓皂苷Ⅱ高劑量組

3 討論

肺癌當前以手術、化療和放療為主，但不良反應大。天然植物類抗腫瘤藥物因其不良反應少成為研究熱點[7]。有研究顯示，重樓皂苷Ⅱ對膀胱癌[8]、肝癌[9]等具有一定作用。本研究通過體外實驗探討重樓皂苷Ⅱ對人非小細胞肺癌A549細胞的作用及相關機制。

CCK-8實驗結果顯示，重樓皂苷Ⅱ可降低細胞存活率，提示重樓皂苷Ⅱ可抑制A549細胞增殖，且隨著藥物濃度增加，抑制效果增強。當線粒體產生能量時，線粒體內膜將質子泵入內膜和外膜之間的空隙，導致大量質子積聚，形成質子梯度，并在兩側產生電位差，從而形成MMP，MMP是評價線粒體功能完整性的指標[10-11]。采用熒光染料JC-10檢測MMP，結果顯示，重樓皂苷Ⅱ處理后，A549細胞MMP降低，提示呼吸鏈受損，線粒體功能異常。線粒體能吸收并釋放Ca2+，從而維持細胞正常功能，如新陳代謝、增殖和凋亡等[12]。Ca2+水平升高導致線粒體Ca2+超負荷，使線粒體外膜通透性增加，線粒體內的Ca2+釋放到細胞質中，誘導線粒體功能障礙[13]。重樓皂苷Ⅱ處理后，細胞內Ca2+水平升高，導致線粒體腫脹、破裂，進而誘導細胞凋亡。低濃度ROS在細胞生理調節中起重要作用，高濃度ROS可產生毒性作用導致細胞死亡[14]。線粒體是產生ROS的主要場所，ROS水平升高可使線粒體膜通透性增加，促進細胞色素C釋放，并激活Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[15-16]。采用DCFH-DA熒光染料檢測細胞內ROS含量，結果顯示，重樓皂苷Ⅱ可增加A549細胞內ROS含量，提示重樓皂苷Ⅱ可使線粒體發生氧化應激反應。

凋亡是細胞程序性死亡的主要方式，在維持組織穩態中起重要作用[17]。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡中起重要調節作用，主要由抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax等組成。凋亡系統激活后，Bax和Bcl-2會在線粒體外膜上形成同型低聚體，并使細胞色素C釋放進入細胞質，誘導Caspase激活[18]。本研究結果表明，重樓皂苷Ⅱ處理后，A549細胞促凋亡蛋白Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達降低，提示重樓皂苷Ⅱ可促進細胞凋亡。

綜上所述，重樓皂苷Ⅱ可誘導細胞凋亡，其作用機制可能與降低A549細胞MMP，提高細胞內Ca2+水平，增加細胞內ROS含量，調節Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達有關。本研究為重樓皂苷Ⅱ用于NSCLC的輔助治療提供了實驗依據。

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Effects of Polyphyllin Ⅱ on Apoptosis of Human Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells

YOU Lijiao, SUN Fangyuan, YANG Xiaofang, GENG Huan, LEI Ming

To observe the effects of polyphyllin Ⅱ on human non-small cell lung cancer A549 cells; To explore its possible mechanism of action.Different concentrations of polyphyllin Ⅱ acted on A549 cells for 48 hours, and the cell survival rate was detected by CCK-8 method. A549 cells were divided into control group, polyphyllin Ⅱ low-, medium-, and high-dosage groups, and JC-10 fluorescent probe was used to detect MMP; Fluo-4 AM fluorescent probe was used to detect intracellular Ca2+level; DCFH-DA fluorescent probe was used to detect intracellular ROS level; Western blot was used to detect the protein expressions of Bax, Bcl-2, and cleaved Caspase-3 in cells.Compared with the control group, the survival rate of A549 cells in each polyphyllin Ⅱ group significantly decreased, with statistical significance (<0.01). The MMP of A549 cells was significantly reduced, the levels of Ca2+and ROS significantly increased, and the expression of Bcl-2 protein was significantly reduced in each polyphyllin Ⅱ group; protein expressions of Bax and cleaved Caspase-3 increased significantly in polyphyllin Ⅱ high-dosage group, with statistical significance (<0.05).Polyphyllin Ⅱ may promote A549 cell apoptosis by reducing cell MMP, increasing intracellular Ca2+level, increasing intracellular ROS content, and regulating apoptosis-related proteins Bcl-2, Bax, cleaved Caspase-3 expression.

non-small cell lung cancer; polyphyllin Ⅱ; A549 cells; mitochondria; apoptosis

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0081-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202103001

國家自然科學基金面上項目（81973649）；浦東新區衛生健康委員會領先人才培養項目（pwr12019-02）；浦東新區衛生健康委員會學科建設項目（PWZy2020-07）；浦東新區衛生健康委員會臨床高原學科建設計劃（PWYgy2018-01）

雷鳴，E-mail：leiming6891@163.com

（收稿日期：2021-03-01）

（修回日期：2021-03-20；編輯：鄭宏）