不同時(shí)間點(diǎn)電針干預(yù)對心肌梗死大鼠心肌保護(hù)及干細(xì)胞因子表達(dá)的比較研究

袁晨越，施佑瑾，郭淑青，薛永鵬，牟芳芳，國海東

不同時(shí)間點(diǎn)電針干預(yù)對心肌梗死大鼠心肌保護(hù)及干細(xì)胞因子表達(dá)的比較研究

袁晨越，施佑瑾，郭淑青，薛永鵬，牟芳芳，國海東

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

觀察不同時(shí)間點(diǎn)電針干預(yù)對心肌梗死（MI）大鼠外周血及心肌組織干細(xì)胞因子（SCF）含量，以及心肌組織細(xì)胞凋亡、膠原纖維沉積和血管新生的影響。采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制作MI模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和電針組，其中電針組又分為造模前1 h、造模后1 h和造模后24 h 3個(gè)亞組，分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)對大鼠進(jìn)行電針干預(yù)，針刺“內(nèi)關(guān)”“心俞”30 min，連續(xù)干預(yù)14次后取材。ELISA檢測大鼠外周血和心肌組織SCF含量，TUNEL染色、Masson染色分別觀察梗死區(qū)細(xì)胞凋亡及膠原纖維沉積，CD31免疫熒光染色檢測梗死區(qū)和梗死周邊微血管密度。與正常組比較，模型組大鼠血清和心肌組織SCF含量均明顯增加；與模型組比較，電針各干預(yù)組大鼠血清和心肌組織SCF含量增加，心肌組織凋亡細(xì)胞數(shù)量和膠原纖維沉積顯著降低，梗死區(qū)和梗死周邊微血管密度明顯升高。其中，造模后1 h電針組改善情況最明顯。MI發(fā)生后1 h內(nèi)電針大鼠“內(nèi)關(guān)”“心俞”可有效提高大鼠外周血和心肌組織SCF含量，改善MI大鼠的預(yù)后。

心肌梗死；電針；干細(xì)胞因子；細(xì)胞凋亡；血管新生；大鼠

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心血管疾病中的急重癥，45歲以下人群發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前，臨床上治療MI主要包括藥物溶栓、介入、手術(shù)等。然而這些治療對梗死心肌組織修復(fù)作用有限，導(dǎo)致疾病后期復(fù)發(fā)維護(hù)成本大大提高。干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）具有明顯促進(jìn)干細(xì)胞歸巢和心肌細(xì)胞修復(fù)的作用。此外，SCF對祖細(xì)胞增殖與分化也起著關(guān)鍵的作用。因此，SCF常被應(yīng)用于器官組織的損傷修復(fù)[2-3]。本研究觀察不同時(shí)間點(diǎn)電針干預(yù)對MI大鼠外周血及心肌梗死組織SCF水平及心肌組織細(xì)胞凋亡、膠原沉積和血管新生的影響，探究不同時(shí)間點(diǎn)電針干預(yù)對MI預(yù)后的影響，尋找電針對MI保護(hù)及修復(fù)的最佳時(shí)機(jī)，為闡明電針保護(hù)及修復(fù)MI心肌細(xì)胞的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級6～8周齡SD大鼠，雄性，36只，體質(zhì)量（300±50）g，上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號SYXK（滬）2014-0008。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由攝食飲水。所有實(shí)驗(yàn)均按照上海中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)和國際動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

ELISA試劑盒（貨號ml102853），上海酶聯(lián)生物科技有限公司；OCT包埋劑（貨號4583），美國SAKURA公司；CD31（貨號ab222783），英國Abcam公司；Alexa Fluor?488山羊抗兔熒光二抗（貨號ab150077），英國Abcam公司；抗熒光淬滅封片劑（貨號H-1200），美國VECTOR公司；TUNEL凋亡試劑盒（貨號C1088），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Masson三色染色液（貨號BP-DL022），森貝伽生物技術(shù)有限公司；華佗牌針灸針（0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。電針治療儀（KWD 808I），常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司；小動(dòng)物呼吸機(jī)（7025），意大利Ugo Basile公司；多功能酶標(biāo)儀（Synergy 2），美國Bio-Tek公司；冰凍切片機(jī)（HM525），美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置熒光顯微鏡（IX51），日本Olympus公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及造模

實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組和電針組，其中電針組又分為造模前1 h、造模后1 h和造模后24 h 3個(gè)亞組。隨機(jī)選取4只大鼠為正常組，不做處理。余32只大鼠參考文獻(xiàn)[4]方法，采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支制作MI模型。隨機(jī)選取6只大鼠為造模前1 h電針組，于造模前1 h進(jìn)行電針預(yù)防性干預(yù)（造模前1 h電針組最終存活3只）。將除造模前1 h電針組外的10只成模大鼠隨機(jī)分為模型組（4只）、造模后1 h電針組（3只）和造模后24 h電針組（3只）。

2.2 電針干預(yù)

電針組大鼠針刺“內(nèi)關(guān)”（前肢內(nèi)側(cè)距腕關(guān)節(jié)約3 mm尺橈骨縫間）及“心俞”（第5胸椎下兩旁肋間），將0.25 mm×13 mm無菌針灸針垂直刺入2～3 mm，行提插捻轉(zhuǎn)手法，左右兩側(cè)分別連接電針治療儀，頻率20 Hz等幅疏密波，電流強(qiáng)度1 mA，留針30 min，每日1次。

造模前1 h電針組、造模后1 h電針組和造模后24 h電針組首次電針時(shí)間分別為造模前1 h、造模后1 h和造模后24 h。然后分別于首次電針后每隔24 h電針治療1次，共14次。正常組和模型組采用與電針組相同的固定方式但不行電針干預(yù)。

2.3 取材

電針干預(yù)結(jié)束后腹主動(dòng)脈采血，4 ℃、3 000×離心5 min，取上清液?？焖偌糸_胸廓，取出心臟，剪去心房，沿梗死區(qū)域中央將心室組織切成兩部分，靠近心底部分用于常規(guī)制備冰凍組織切片，靠近心尖部分用于ELISA檢測。

2.4 ELISA檢測

將組織取出，稱重后加入對應(yīng)體積PBS，制成組織勻漿，4 ℃、5 000×離心5～10 min，取上清液。另取離心后的大鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀波長450 nm處測定OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清及心肌組織SCF含量。

2.5 Masson染色

取冰凍切片，0.01 mol/L PBS清洗。在組織上滴加Bouin液，置于37 ℃烘箱2 h，流水沖洗切片至黃色消失。滴加100 μL天青石藍(lán)染色液，染色2～3 min，水洗。滴加Mayer蘇木素染色液，染色2～3 min，水洗。酸性乙醇分化液處理1～2 min，流水沖洗10 min。滴加麗春紅酸性品紅染色液，染色10 min，蒸餾水沖洗。磷鉬酸溶液處理約10 min，傾去液體，滴加苯胺藍(lán)染色劑襯染5 min，蒸餾水沖洗，脫水和透明后中性樹脂封片。觀察膠原纖維沉積，計(jì)算百分比。

2.6 TUNEL染色

取冰凍切片，0.01 mol/L PBS洗2次。0.5%Triton X-100室溫處理5 min，0.01 mol/L PBS洗2次。根據(jù)試劑盒說明書配制TUNEL檢測液，每個(gè)樣品加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min。0.01 mol/L PBS洗3次，用抗熒光淬滅封片劑封片，觀察高倍視野凋亡細(xì)胞數(shù)量。

2.7 CD31免疫熒光染色

取冰凍切片，0.01 mol/L PBS洗2次。正常山羊血清37 ℃處理30 min封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。滴加一抗，4 ℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS沖洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育1 h。0.01 mol/L PBS沖洗3次。滴加DAPI，室溫染色5～10 min。0.01 mol/L PBS浸洗，用抗熒光淬滅封片劑封片，觀察梗死區(qū)和梗死周邊微血管密度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 電針對模型大鼠血清干細(xì)胞因子含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清SCF含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，電針各組大鼠血清SCF含量明顯增加（＜0.05）。結(jié)果見圖1。

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

4.2 電針對模型大鼠心肌組織干細(xì)胞因子含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠心肌組織SCF含量明顯增加（＜0.05）；與模型組比較，電針各組大鼠心肌組織SCF含量明顯增加（＜0.05，＜0.01），其中造模后1 h電針組增加最明顯。結(jié)果見圖2。

4.3 電針對模型大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的影響

MI發(fā)生后出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，經(jīng)電針干預(yù)后各組大鼠心肌組織凋亡細(xì)胞數(shù)量減少。造模后1 h電針組凋亡細(xì)胞數(shù)量最少，明顯低于其他各組。造模前1 h電針組和造模后24 h電針組凋亡細(xì)胞數(shù)量較模型組減少，但高于造模后1 h電針組。結(jié)果見圖3。

4.4 電針對模型大鼠梗死區(qū)膠原纖維沉積的影響

模型組大鼠梗死區(qū)可見大量心肌細(xì)胞被膠原纖維所取代；電針各組大鼠梗死區(qū)膠原纖維沉積明顯減少。造模后1 h電針組大鼠梗死區(qū)膠原纖維沉積數(shù)量最少，明顯低于其他各組。造模前1 h電針組和造模后24 h電針組大鼠梗死區(qū)膠原纖維沉積數(shù)量均低于模型組，但高于造模后1 h電針組。結(jié)果見圖4。

注：與模型組比較，##P＜0.01；與造模后1 h電針組比較，△P＜0.05

注：與模型組比較，**P＜0.01；與造模后1 h電針組比較，##P＜0.01

4.5 電針對模型大鼠心肌組織梗死區(qū)血管新生的影響

CD31免疫熒光染色顯示，與模型組比較，造模后1 h電針組和造模前1 h電針組大鼠梗死區(qū)和梗死周邊微血管密度顯著升高（＜0.01，＜0.05），造模后1 h電針組大鼠梗死區(qū)和梗死周邊微血管密度明顯高于造模前1 h電針組和造模后24 h電針組（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見圖5。

注：與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與造模后1 h電針組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

5 討論

中醫(yī)認(rèn)為，MI基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以陽虛、氣虛為主，標(biāo)實(shí)則以血瘀最為重要。氣虛血瘀是貫穿MI的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)。研究表明，“內(nèi)關(guān)”“心俞”兩穴對缺血性心臟病心肌細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用[5]。內(nèi)關(guān)為手厥陰心包經(jīng)絡(luò)穴，也是連通陰維脈的八脈交會(huì)穴。《備急千金要方》有“凡心實(shí)者，則心中暴痛……惕然不能動(dòng)……內(nèi)關(guān)主之”。心俞是心之背俞穴，背俞穴作為臟腑之氣灌注于背部的穴位，與相應(yīng)臟腑聯(lián)系密切?！夺樉募滓医?jīng)》對其有“寒熱心痛……與背相引而痛”的論述。兩穴臨床治療MI應(yīng)用廣泛。有研究發(fā)現(xiàn)，兩穴改善心功能方面具有一定協(xié)同治療作用[6-7]。

心肌細(xì)胞作為終末分化的成熟細(xì)胞，當(dāng)遇到缺血缺氧等病理狀況時(shí)會(huì)發(fā)生大量凋亡。正常情況下，心肌細(xì)胞凋亡有利于清除受損細(xì)胞，對體內(nèi)微環(huán)境平衡及新細(xì)胞產(chǎn)生具有促進(jìn)作用[8]。但病理狀態(tài)下大量心肌細(xì)胞凋亡會(huì)加重心肌組織受損。研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致MI心功能減退和病理性心肌重構(gòu)的重要因素，梗死區(qū)面積大小與MI發(fā)生后心肌細(xì)胞凋亡程度密切相關(guān)[9]。因此，MI早期抑制心肌細(xì)胞凋亡將有效減少梗死面積，改善預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電針各組大鼠心肌組織凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，梗死區(qū)膠原纖維沉積明顯降低。其中以造模后1 h電針組凋亡細(xì)胞數(shù)量和梗死區(qū)膠原纖維沉積最少，造模前1 h電針組和造模后24 h電針組凋亡細(xì)胞數(shù)量和梗死區(qū)膠原纖維沉積雖高于造模后1 h電針組，而較模型組降低。提示MI發(fā)生后較早電針干預(yù)可改善大鼠缺血狀態(tài)下心肌組織壞死，同時(shí)表明，MI發(fā)生前電針預(yù)防對抑制缺血心肌組織損傷具有一定作用。

與心肌細(xì)胞凋亡相對應(yīng)的是MI梗死區(qū)和梗死周邊血管新生[10]，新生血管對恢復(fù)血流和改善心肌細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)具有重要意義[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，血管新生機(jī)制與抗細(xì)胞凋亡之間可能存在某種交叉作用[13-14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，造模后1 h電針組和造模前1 h電針組大鼠梗死區(qū)和梗死周邊微血管密度顯著升高，其中造模后1 h電針組微血管密度最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MI發(fā)生前后短時(shí)間電針刺激大鼠“內(nèi)關(guān)”“心俞”可有效促進(jìn)其心肌組織梗死區(qū)及梗死周邊血管新生，有利于改善MI大鼠預(yù)后。

SCF是c-kit配體，對細(xì)胞分化、生長、歸巢等有重要的調(diào)控作用。MI發(fā)生后心肌組織的梗死區(qū)通過產(chǎn)生部分趨化細(xì)胞因子吸引循環(huán)干細(xì)胞進(jìn)入并介導(dǎo)心肌組織再生，參與損傷修復(fù)[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，電針MI大鼠“內(nèi)關(guān)”“心俞”后，大鼠外周血及心肌組織SCF含量較模型組明顯增加，推測可能與電針促進(jìn)干細(xì)胞向缺血區(qū)“歸巢”機(jī)制有關(guān)[16]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，造模后1 h電針組大鼠心肌組織SCF含量高于造模后24 h電針組，提示病理情況下早期電針干預(yù)更有利于機(jī)體調(diào)動(dòng)自身的干細(xì)胞，從而盡可能維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡。而電針預(yù)防也可對MI大鼠心肌缺血損傷起到一定的保護(hù)作用。

綜上所述，MI發(fā)生后短時(shí)間內(nèi)電針大鼠“內(nèi)關(guān)”“心俞”可有效提高大鼠血清及心肌組織SCF含量，改善預(yù)后。在MI發(fā)生前電針大鼠“內(nèi)關(guān)”“心俞”可對大鼠MI損傷起到一定的預(yù)防作用。此外，我們推測，電針刺激加快了循環(huán)干細(xì)胞向缺血區(qū)“歸巢”并介導(dǎo)心肌組織的再生，抑制心肌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)梗死區(qū)和梗死周邊血管新生。

[1] 中國心血管健康與疾病報(bào)告編寫組.中國心血管健康與疾病報(bào)告2019概要[J].中國循環(huán)雜志,2020,35(9)：833-854.

[2] LENNARTSSON J, RONNSTRAND L. Stem cell factor receptor/c-Kit：from basic science to clinical implications[J]. Physiol Rev, 2012,92(4)：1619-1649.

[3] 郭軍,林國生,鮑翠玉,等.干細(xì)胞因子對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響[J].中國醫(yī)師雜志,2004,6(12)：1601-1604.

[4] SRIKANTH G, PRAKASH P, TRIPATHY N, et al. Establishment of a rat model of myocardial infarction with a high survival rate：A suitable model for evaluation of efficacy of stem cell therapy[J]. J Stem Cells Regen Med,2009,5(1)：30-36.

[5] 杜慧靜,陳峰,唐關(guān)敏,等.電針“內(nèi)關(guān)、心俞”穴對急性心肌梗死大鼠SDF-1、VCAM-1表達(dá)影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,40(1)：49- 53.

[6] 李夢.電針內(nèi)關(guān)、心俞改善急性心肌缺血大鼠血流變參數(shù)的協(xié)同作用[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(2)：11-13.

[7] 唐玉紅,姚遠(yuǎn),陳德森,等.電針內(nèi)關(guān)、心俞及關(guān)元俞對急性心肌缺血兔心功能的影響[J].國際中醫(yī)中藥雜志,2014,36(12)：1104-1106.

[8] 劉瑞杰,李文峰,蘭軍.過表達(dá)IGF-1的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物對缺氧心肌細(xì)胞的抗凋亡作用[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2020,51(10)：1073-1079.

[9] LEHRKE S, MAZHARI R, DURAND D J, et al. Aging impairs the beneficial effect of granulocyte colony-stimulating factor and stem cell factor on post-myocardial infarction remodeling[J]. Circ Res,2006,99(5)：553-560.

[10] 莫壁伶,黃子祥,黃帥,等.低氧預(yù)處理脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植對小鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡及血管新生的影響[J].山東醫(yī)藥,2018, 58(33)：28-31.

[11] 張燁,肖軼,余國龍.間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體促心肌梗死血管新生及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究,2020,24(2)：153-159.

[12] OHTSUKA M, TAKANO H, ZOU Y, et al. Cytokine therapy prevents left ventricular remodeling and dysfunction after myocardial infarction through neovascularization[J]. FASEB J,2004,18(7)：851-853.

[13] 施洋,候?qū)毩?黨曉玲,等.血管新生在心肌梗死中作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2020,32(1)：95-99.

[14] XIANG F L, LU X, HAMMOUD L, et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice[J]. Circulation,2009,120(12)：1065-1074.

[15] 楊敏,閆純英,吳賢仁,等.干細(xì)胞因子動(dòng)員骨髓干細(xì)胞歸巢梗死心肌的特性變化[J].中國臨床康復(fù),2005,9(26)：67-70.

[16] KWON S G, PARK I, KWON Y W, et al. Role of stem cell mobilization in the treatment of ischemic diseases[J]. Arch Pharm Res,2019, 42(3)：224-231.

Comparative Study on Effects of Electroacupuncture at Different Time Points on Myocardial Protection and Stem Cell Factor Expression in Rats with Myocardial Infarction

YUAN Chenyue, SHI Youjin, GUO Shuqing, XUE Yongpeng, MOU Fangfang, GUO Haidong

To observe the effects of electroacupuncture at different time points on the contents of stem cell factor (SCF) in peripheral blood and myocardial tissue, and myocardial cell apoptosis, collagen fibers deposition and angiogenesis in rats with myocardial infarction (MI).A model of MI was established by ligating the anterior descending branch of the left coronary artery. Experimental rats were randomly divided into normal group, model group, and electroacupuncture group. Electroacupuncture group was divided into three subgroups (1 hour before modeling, 1 hour after modeling and 24 hours after modeling). Rats were treated with electroacupuncture at corresponding time points. The electroacupuncture group was treated with acupuncture at “Neiguan” and “Xinshu” for 30 min for 14 times. The contents of SCF in peripheral blood and myocardial tissues were detected by ELISA. TUNEL and Masson staining were used to observe cell apoptosis and collagen fibers deposition in the infarct area. CD31 immunofluorescence staining was used to detect the microvessel density around the infarct and the infarct area.Compared with the normal group, the SCF content in serum and myocardial tissue of the model group significantly increased. Compared with the model group, the SCF content in serum and myocardial tissue increased, the number of apoptotic cells and the deposition of collagen fibers in myocardial tissue decreased, the microvessel density around the infarct and the infarct area significantly increased in the electroacupuncture intervention groups. Theimprovement in electroacupuncture group of 1 hour after modeling was the most obvious.Electroacupuncture at acupoints of “Neiguan” and “Xinshu” within 1 hour after MI can effectively increase the content of SCF in the peripheral blood and myocardial tissue, thus improving the prognosis of rats with MI.

myocardial infarction; electroacupuncture; stem cell factor; apoptosis; angiogenesis; rats

R245

A

1005-5304(2021)10-0070-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202102018

國家自然科學(xué)基金（81673729、81704157）

國海東，E-mail：hdguo@shutcm.edu.cn

（收稿日期：2021-02-01）

（修回日期：2021-02-12；編輯：華強(qiáng)）