復方鉤藤降壓片對高血壓模型大鼠血壓及血管內皮功能的影響

藺曉源，易健，雍蘇南，鄧娜

復方鉤藤降壓片對高血壓模型大鼠血壓及血管內皮功能的影響

藺曉源1，易健1，雍蘇南1，鄧娜2

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007； 2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208

觀察復方鉤藤降壓片對高血壓模型大鼠血壓和血管內皮功能的影響。30只SD大鼠隨機分為正常組（6只）和造模組（24只），采用腹腔注射N’-硝基-L-精氨酸（L-NNA）建立內皮損傷型高血壓大鼠模型，將22只成模大鼠隨機分為模型組（7只）、西藥組（7只）和中藥組（8只），中藥組給予復方鉤藤降壓片（22.845 g/kg）藥液灌胃，西藥組給予卡托普利（7.615 mg/kg）混懸液灌胃，正常組和模型組給予等體積純凈水灌胃，連續4周。分別在給藥前及給藥1、2、3、4周測量大鼠收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）；ELISA檢測大鼠血清一氧化氮（NO）、內皮素（ET）-1含量；HE染色觀察大鼠胸主動脈病理形態；免疫組化檢測胸主動脈內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、ET-1表達。與正常組比較，模型組大鼠尾動脈SBP和DBP均顯著升高（＜0.01），血清NO含量顯著減少（＜0.01），ET-1含量顯著增加（＜0.01）；胸主動脈內膜結構紊亂，內皮不完整，有凸起及缺損，中膜增厚，外膜與中膜分界欠佳；胸主動脈eNOS表達顯著降低（＜0.01），ET-1表達顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，給藥1、2、3、4周，中藥組大鼠尾動脈SBP、DBP均明顯降低（＜0.01），血清NO含量增加，ET-1含量減少（＜0.01）；胸主動脈內膜結構改善，內皮基本完整，內膜較光滑，外膜與中膜分界較清楚；胸主動脈eNOS表達升高（＜0.05），ET-1表達明顯降低（＜0.05）。復方鉤藤降壓片可糾正L-NNA致高血壓大鼠NO、ET-1水平失衡，改善血管內皮功能障礙，具有良好的降壓及血管內皮保護作用。

高血壓；復方鉤藤降壓片；血管內皮；一氧化氮；內皮素-1；大鼠

高血壓是臨床常見的心腦血管疾病，已成為全球重大公共衛生問題和首要的死亡危險因素。據統計，全球每年有700萬人死于高血壓，預計到2025年，全球約15.6億人患有高血壓[1]。中國心血管病報告2016年數據顯示，我國高血壓患者已超過2.45億，并以每年1 000萬人的速度遞增[2]。因此，提高高血壓的防治水平已成為當前亟需解決的重大醫學問題。本課題組研究認為，高血壓為本虛標實之證，具有虛、瘀、風的中醫病機特點。針對此病機，采用養陰柔肝、化瘀通絡的復方鉤藤降壓片干預，能降低患者血壓、改善臨床癥狀[3]。目前研究認為，血管內皮功能障礙是高血壓最早期和最重要的血管損害，在高血壓的發生發展中起著重要作用[4]。因此，本研究通過腹腔注射N’-硝基-L-精氨酸（L-NNA）建立內皮損傷型高血壓大鼠模型，觀察復方鉤藤降壓片對模型大鼠尾動脈血壓、胸主動脈病理形態及血管活性物質一氧化氮（NO）、內皮素（ET）-1含量的影響，為明確其治療高血壓血管內皮損傷的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，體質量200～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（湘）2016-002，使用許可證號SYXK（湘）2015-0003。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新實驗中心SPF級動物房。

1.2 藥物及制備

復方鉤藤降壓片由鉤藤、天麻、川芎、當歸、白芍、野菊花組成，飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥房。所有飲片混勻后加水煎煮2次，合并2次煎液，濃縮至原藥材濃度為2.284 5 g/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。卡托普利，華中藥業股份有限公司，批號20190203，25 mg/片，研碎后用純凈水配制成濃度為0.761 5 mg/mL的混懸液，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

L-NNA（大連美侖生物技術有限公司，貨號66036-77-9），NO、ET-1 ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號分別為FY3656-B、FY3435-B），內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、ET-1一抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號分別為A15075、A0686），即用型SABC-POD（兔IgG）試劑盒、DAB顯色試劑盒、Mayor’蘇木素、中性樹膠（武漢博士德生物工程有限公司，貨號分別為SA1022、AR1022、AR0005、AR0038）。BP2010無創血壓檢測儀（北京軟隆科技有限責任公司），Enspire多功能酶標儀（美國Perkinelmer公司），BX43熒光顯微鏡、Image Pro Plus 6.0圖像分析系統（日本Olympus公司），Hei-VAP旋轉蒸發儀（德國Heidolph公司），Z32HK高速冷凍離心機（德國Hermle公司），Purelab Classic UVF超純水儀（英國ELGA LabWater公司），AUW120D精密電子天平（日本島津）。

1.4 分組、造模及給藥

大鼠適應性喂養5 d，采用隨機數字表法取6只作為正常組，不予造模。其余24只大鼠按15 mg/kg劑量腹腔注射L-NNA水溶液（1 mg/mL）制備高血壓大鼠模型[5]，2次/d，連續21 d。造模期間每周檢測大鼠尾動脈血壓1次，以收縮壓（SBP）≥160 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa）為造模成功。將成模大鼠（22只）隨機分為模型組（7只）、西藥組（7只）和中藥組（8只）。中藥組每日給予復方鉤藤降壓片藥液（22.845 g/kg，相當于臨床成人劑量3倍）灌胃，西藥組每日給予卡托普利混懸液（7.615 mg/kg，臨床成人等效劑量）灌胃，正常組和模型組給予等體積純凈水灌胃。給藥體積10 mL/kg，連續4周。

1.5 取材

大鼠末次給藥后2 h，腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，置于冰上開胸，真空采血管心臟取血5 mL，靜置30 min，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，置于-80 ℃冰箱保存；取血后迅速剝離胸主動脈，預冷PBS漂洗，放入4%多聚甲醛中固定保存。

1.6 指標檢測

1.6.1 尾動脈血壓測定

分別于給藥前及給藥1、2、3、4周測量大鼠SBP和舒張壓（DBP）。打開無創血壓檢測儀加熱裝置，溫度設置為38 ℃，將大鼠置于固定網套中固定，預熱3 min，使大鼠尾部動脈擴張，將壓脈套套在大鼠尾部近心端1/3處，電腦上打開脈沖波形記錄系統，當波形規律時感應器自動加壓測量，讀取血壓值。每只大鼠重復測量3次，取平均值。

1.6.2 HE染色

取胸主動脈置于4%多聚甲醛中固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片，烤片機烘烤，脫蠟至水，染色，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。每組隨機選5個樣本。

1.6.3 血清一氧化氮、內皮素-1含量檢測

取大鼠血清，ELISA檢測血清NO、ET-1含量，嚴格按試劑盒說明書進行操作。以空白孔調零，波長450 nm處測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

1.6.4 免疫組化檢測大鼠胸主動脈內皮型一氧化氮合酶、內皮素-1表達

胸主動脈切片常規脫蠟，抗原修復，5%BSA封閉液封閉，分別滴加eNOS、ET-1一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，加入生物素標記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，滴加SABC，DAB顯色，蘇木素復染，封片。每張切片隨機取3個視野，使用Image Pro Plus 6.0測量陽性染色面積（A）和積分光密度（IOD），計算平均光密度（MOD），MOD＝IOD/A。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 復方鉤藤降壓片對模型大鼠尾動脈血壓的影響

與同一時間點正常組比較，模型組大鼠尾動脈SBP、DBP顯著升高（＜0.01）；給藥后與同一時間點模型組比較，西藥組和中藥組大鼠尾動脈SBP、DBP明顯降低（＜0.01），西藥組SBP降低程度優于中藥組（＜0.05，＜0.01），給藥4周后，中藥組DBP降低程度優于西藥組（＜0.05）。結果見表1、表2。

表1 各組大鼠不同時間點尾動脈SBP比較（±s，mm Hg）

注：與同一時間點正常組比較，**＜0.01；與同一時間點模型組比較，##＜0.01；與同一時間點西藥組比較，△＜0.05，△△＜0.01

表2 各組大鼠不同時間點尾動脈DBP比較（±s，mm Hg）

注：與同一時間點正常組比較，**＜0.01；與同一時間點模型組比較，##＜0.01；與同一時間點西藥組比較，△＜0.05

2.2 復方鉤藤降壓片對模型大鼠胸主動脈病理形態的影響

正常組大鼠胸主動脈內膜結構正常，內皮完整，表面光滑，無凸起及缺損，中膜平滑肌細胞排列整齊，外膜與中膜分界明顯；模型組大鼠胸主動脈內膜結構紊亂，內皮不完整，有凸起及缺損，中膜增厚，外膜與中膜分界欠佳；中藥組和西藥組大鼠胸主動脈內膜結構較模型組均有不同程度改善，內膜較光滑，內皮基本完整，外膜與中膜分界較清晰。見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動脈形態（HE染色，×200）

2.3 復方鉤藤降壓片對模型大鼠血清一氧化氮、內皮素-1含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清NO含量明顯減少，ET-1含量明顯增加（＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥組大鼠血清NO含量明顯增加，ET-1含量明顯減少，差異有統計學意義（＜0.01，＜0.05）。中藥組與西藥組比較差異無統計學意義（＞0.05）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清NO、ET-1含量比較（±s）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.4 復方鉤藤降壓片對模型大鼠胸主動脈內皮型一氧化氮合酶、內皮素-1表達的影響

eNOS、ET-1陽性表達在胸主動脈分布較廣，血管內膜、中膜平滑肌細胞胞漿內及外膜纖維中均有分布，呈棕黃色顆粒。與正常組比較，模型組大鼠胸主動脈eNOS表達顯著降低，ET-1表達顯著升高，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠胸主動脈eNOS表達明顯升高，ET-1表達明顯降低，差異有統計學意義（＜0.05），西藥組大鼠胸主動脈ET-1表達明顯降低，差異有統計學意義（＜0.05）。結果見表4、圖2、圖3。

表4 各組大鼠胸主動脈eNOS、ET-1陽性表達比較（±s，MOD）

注：與正常組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05

圖2 各組大鼠胸主動脈eNOS陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖3 各組大鼠胸主動脈ET-1陽性表達（免疫組化染色，×400）

3 討論

高血壓是遺傳和環境因素共同作用的結果，但其發病機制尚未完全闡明。血管內皮細胞（VEC）作為血管壁的重要組成部分，可分泌多種活性肽，在維持血管舒縮平衡方面扮演重要角色，其中NO和ET是調節血管平滑肌舒縮功能的重要物質。NO是VEC產生的舒張血管的關鍵活性物質，也是目前研究VEC作用機制最特異的因子之一[6]。一氧化氮合酶（NOS）是合成NO的關鍵酶，可維持NO濃度和內皮功能，主要分為eNOS、神經元型一氧化氮合酶和誘導型一氧化氮合酶。eNOS參與合成NO，調節血管功能[7]，其表達水平是影響NO產生的重要因素。ET-1是VEC產生的內源性血管收縮因子，是ET的重要亞型，也是目前已知收縮血管作用最強、最持久的細胞因子[8]。生理條件下，NO與ET處于動態平衡；疾病狀態下，VEC功能和結構均發生改變，失去正常的內皮功能，稱為“內皮功能障礙”，其主要特點是NO生物利用減少，ET合成增多[9]。內皮功能障礙的發生增加高血壓的易感性[10]。研究表明，高血壓模型大鼠血漿中內皮舒縮因子水平失衡，表現為NO水平降低，ET-1水平升高[11]。因此，測定血清中NO、ET-1含量和血管組織eNOS、ET-1表達水平能準確反映血管內皮功能狀態和損傷程度。

L-NNA為NOS抑制劑，本研究采用L-NNA誘導高血壓大鼠模型，抑制NO合成，導致內皮依賴性舒張功能障礙，血壓升高，同時破壞內皮細胞正常狀態，形成惡性循環。造模1周后，模型組大鼠尾動脈SBP、DBP即顯著升高，至造模2周后血壓持續穩定，達到高血壓造模成功標準。給藥前與正常組比較，模型組大鼠尾動脈SBP、DBP均顯著升高，提示造模成功。給藥1、2、3、4周，模型組大鼠SBP、DBP均較正常組明顯升高，提示模型穩定，且模型組血清NO含量和胸主動脈eNOS陽性表達顯著低于正常組，血清ET-1含量和胸主動脈ET-1陽性表達顯著高于正常組，表明模型大鼠血管內皮功能受損。結合模型組胸主動脈HE染色提示內膜結構紊亂，內皮不完整，有凸起、缺損，中膜增厚，外膜與中膜分界欠佳，表明模型大鼠血管內皮結構受損。因此，腹腔注射L-NNA建立內皮損傷型高血壓大鼠模型穩定可靠。

高血壓屬中醫學“眩暈”等范疇，為本虛標實之證，以肝腎陰虛為本，肝陽上亢、瘀血阻絡為標，具有虛、瘀、風的病機特點，治宜養陰柔肝、化瘀通絡[12]。復方鉤藤降壓片方中鉤藤清熱平肝、熄風降壓為君藥；天麻平肝潛陽、熄風止痙，助君藥加強平肝熄風之力，白芍養陰柔肝、平抑肝陽，當歸補血養陰、活血通脈，川芎活血行氣，共為臣藥；佐以野菊花清熱平肝，以折其陽亢。諸藥合用可補陰虛、平陽亢、化瘀血、通脈絡，使陰虛得補、陽亢得制、瘀血得化、脈絡得通，則眩暈自止，共奏養陰柔肝、化瘀通絡之功。現代藥理研究表明，當歸揮發油降壓作用可能與腎素-血管緊張素-醛固酮系統有關[13]；川芎超臨界萃取物對正常大鼠也有明顯降壓作用[14]；野菊花水煎液對高血壓大鼠有一定降壓作用[15]。前期研究表明，復方鉤藤降壓片治療高血壓陰虛陽亢、瘀血阻絡證療效明確，可降低患者血壓和中醫證候積分，且安全性較好[3，16]。動物研究發現，復方鉤藤降壓片降低自發性高血壓大鼠血壓及防治靶器官損害的機制可能與降低炎癥介質C反應蛋白、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6水平有關[17]。其減輕炎癥反應、調節血管重塑作用可能與下調自發性高血壓大鼠胸主動脈壁單核細胞趨化蛋白-1、基質金屬蛋白酶-9表達有關[18]。

本研究結果顯示，復方鉤藤降壓片能降低L-NNA致高血壓大鼠尾動脈SDP、DBP，改善模型大鼠胸主動脈內膜結構受損，增加舒張血管物質NO合成，減少收縮血管物質ET-1合成。免疫組化檢測進一步證實，復方鉤藤降壓片能降低高血壓大鼠胸主動脈ET-1表達，升高eNOS表達。以上結果表明，復方鉤藤降壓片對L-NNA致高血壓大鼠模型具有良好的降壓及血管內皮保護作用，其可糾正血管活性物質NO、ET-1水平失衡，通過改善血管內皮功能障礙、調節血管張力降低血壓，可為高血壓中醫臨床辨治提供依據。

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Effects of CompoundTablets on Blood Pressure and Vascular Endothelial Function in Hypertensive Rats

LIN Xiaoyuan1, YI Jian1, YONG Sunan1, DENG Na2

To study the effects of compoundTablets on blood pressure and vascular endothelial function in hypertensive rats.Totally 30 SD rats were randomly divided into normal group (6 rats) and modeling group (24 rats). An intraperitoneal injection of N’-nitro-L-arginine (L-NNA) was used to establish a rat model of endothelial injury type hypertension. And then the modeling group (22 rats) was randomly divided into model group (7 rats), Western medicine group (7 rats) and TCM group (8 rats). TCM group was given compoundTablets liquid (22.845 g/kg), Western medicine group was given captopril suspension (7.615 mg/kg), the normal group and model group were given equal volume of purified water, for successive 4 weeks. The systolic blood pressure (SBP) and diastolic blood pressure (DBP) of rats in each group were measured before and after 1, 2, 3, 4 weeks administration respectively. After materials taken, the contents of serum nitric oxide (NO) and endothelin-1 (ET-1) were detected by ELISA method; pathological morphological changes of thoracic aorta were observed by HE staining method; the positive expressions of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and ET-1 in thoracic aorta were detected by immunohistochemistry.Compared with the normal group, the caudal artery SBP and DBP significantly increased in the model group (<0.01); serum NO content was significantly reduced (<0.01); ET-1 content significantly increased (<0.01); thoracic aorta intimal structure was disordered, endothelium was incomplete with bulges and defects, media thickened, and boundary between adventitia and media was poor; the expression of eNOS in the thoracic aorta was significantly reduced (<0.01); the expression of ET-1 significantly increased (<0.01). Compared with the model group, the SBP and DBP of the caudal artery of rats in TCM group were significantly decreased (<0.01); serum NO content increased; ET-1 content significantly reduced (<0.01); the structure of the thoracic aorta intima was improved, the endothelium was basically intact, the intima was smoother, and boundary between adventitia and media was clear; the expression of eNOS in the thoracic aorta significantly increased (<0.05); the expression of ET-1 significantly decreased (<0.05).CompoundTablets can correct the balance disorder of vasoactive substance NO and ET-1 in hypertensive rat model caused by L-NNA, which can improve vascular endothelial dysfunction, with good antihypertensive and vascular endothelial protective effects.

hypertensive disease; compoundTablet; vascular endothelial; nitric oxide; endothelin-1; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)10-0075-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202102074

國家科技重大專項－重大新藥創制（2019ZX09301-103）；國家自然科學基金（81804077）；湖南省研究生科研創新項目（CX20190577）；湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地開放基金（ZYFT201801）；湖南中醫藥大學中醫學國內一流建設學科（2018年）

鄧娜，E-mail：243671178@qq.com

（收稿日期：2021-03-01）

（修回日期：2021-03-20；編輯：華強）