基于指紋圖譜的四神丸多成分質量控制研究

魏偉，侯建忠，朱順娟，盛雪燕，郭華榮

基于指紋圖譜的四神丸多成分質量控制研究

魏偉1，侯建忠1，朱順娟1，盛雪燕2，郭華榮1

1.酒泉市藥品檢驗檢測中心，甘肅 酒泉 735000；2.酒泉市人民醫院，甘肅 酒泉 735000

建立四神丸HPLC指紋圖譜及多成分含量測定方法，并結合聚類分析和主成分分析對其進行質量評價。采用InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，檢測波長230 nm，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，對不同廠家的14批四神丸樣品進行質量分析。運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）計算相似度，確定共有特征峰。利用SPSS20.0和SIMCA-P11.5軟件對確定的共有特征峰進行聚類分析和主成分分析，評價樣品間的質量差異，并對10種成分進行含量測定。建立了四神丸的HPLC指紋圖譜，確定30個共有峰，指認了其中10個特征峰，14批樣品與對照指紋圖譜的相似度為0.967～0.996。對補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫二異丁香酚進行含量測定，方法學考察結果均符合要求。聚類分析和主成分分析可將14批四神丸樣品分為四類，結果提示同一廠家樣品基本可歸為一類，不同廠家樣品差異較大。本研究建立的四神丸指紋圖譜專屬性強，含量測定結果準確可靠，可用于四神丸的鑒別和整體質量控制，并為其質量標準的修訂提供依據。

四神丸；指紋圖譜；高效液相色譜法；聚類分析；主成分分析；質量控制

四神丸是治療五更瀉的名方，主要由肉豆蔻（煨）、補骨脂（鹽炒）、五味子（醋制）、吳茱萸（制）組成，功效溫腎散寒、澀腸止瀉[1]，臨床廣泛用于脾腎陽虛型泄瀉、潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征等[2]。

目前，受中藥材質量、生產工藝等因素的影響，中藥制劑質量存在較大差異。蘇建等[3]利用HPLC同時測定四神丸中7種有效成分含量，結果樣品各成分含量差異較大。烏曰根等[4]基于指紋圖譜技術分析四神丸中吳茱萸的有效成分，但未深入研究指紋圖譜所含信息。現行標準以補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素總量控制制劑質量[1]，無法充分反映四神丸多成分協同發揮藥效的特征。指紋圖譜結合多指標成分定量分析，不僅可鑒別真偽，還可通過主要特征峰的定量測定，實現制劑質量的全面控制[5]。本研究通過對6個廠家14批四神丸HPLC圖的全面分析，建立指紋圖譜，并測定補骨脂主要活性成分補骨脂素和異補骨脂素，五味子有效成分五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲，吳茱萸有效成分吳茱萸堿和吳茱萸次堿，肉豆蔻有效成分去氫二異丁香酚的含量，進一步采用聚類分析和主成分分析歸類比較不同批次樣品差異，以期完善四神丸的質量評價標準，提升質量控制水平。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀（包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器），安捷倫科技（中國）有限公司；XP205DR型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ-500DE超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司。

對照品五味子醇甲（批號110857-201815，純度99.7%）、五味子甲素（批號110764-201915，純度99.5%）、五味子乙素（批號110765-201813，純度99.1%）、五味子酯甲（111529-201706，純度95.2%）、補骨脂素（批號110739-201918，純度99.6）、異補骨脂素（批號110738-202016，純度99.4%）、吳茱萸堿（批號110802-201710）、吳茱萸次堿（批號110801-201608，純度99.7%）、去氫二異丁香酚（批號111838-201804，純度98.6%），中國食品藥品檢定研究院；對照品五味子醇乙（批號B21323，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司。甲醇為色譜純，水為自制超純水。四神丸樣品購自當地藥店和京東大藥房（樣品信息見表1），陰性樣品所需飲片由酒泉市神舟藥業有限公司提供，經甘肅省藥品檢驗研究院馬瀟主任中藥師鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）規定，由酒泉市中醫院制劑室按藥典方法制備。

表1 14批四神丸樣品信息

編號生產廠家規格批號 S1山西華康藥業股份有限公司9 g×6袋20170802 S2山西華康藥業股份有限公司9 g×6袋20191001 S3山西華康藥業股份有限公司9 g×6袋20191202 S4山西華康藥業股份有限公司9 g×6袋20200202 S5山西華康藥業股份有限公司9 g×6袋20200501 S6山西華康藥業股份有限公司9 g×6袋20200801 S7北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司27 g/瓶19080106 S8北京同仁堂天然藥物（唐山）有限公司27 g/瓶20080043 S9河南省康華藥業股份有限公司6 g×10袋20071701 S10河南省康華藥業股份有限公司6 g×10袋20071801 S11孔圣堂（唐山）制藥有限公司60 g/瓶200302 S12孔圣堂（唐山）制藥有限公司60 g/瓶200304 S13藥都制藥集團股份公司9 g×10袋190501 S14洛陽順勢藥業有限公司9 g×10袋20200901

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

分別精密稱取補骨脂素、異補骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫二異丁香酚對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.415、0.504、0.539、0.522、0.637、0.468、0.462、0.329、0.388、0.414 mg/mL的對照品貯備液，分別精密量取上述對照品貯備液1.00 mL至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得。

2.1.2 供試品溶液

取四神丸樣品適量，研細（過100目篩），取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液

按2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）“四神丸”項下處方量和制法分別制備缺肉豆蔻、補骨脂、五味子、吳茱萸的陰性樣品，各取1.0 g，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件

采用InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，40%B；5～25 min，40%～30%B；25～45 min，30%B；45～50 min，30%～15%B；50～70 min，15%B），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長230 nm，進樣量10 μL。各成分色譜峰理論板數均不低于4 000。

2.2.2 精密度試驗

取同一批四神丸樣品（S2），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰，以吳茱萸堿色譜峰為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD≤0.15%、相對峰面積RSD≤1.51%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗

取同一批四神丸樣品（S2）6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰，以吳茱萸堿色譜峰為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD≤0.22%、相對峰面積RSD≤1.82%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗

取同一批四神丸樣品（S2），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄色譜峰，以吳茱萸堿色譜峰為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間RSD≤0.38%、相對峰面積RSD≤1.64%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 相似度評價

取四神丸樣品（S1～S14）粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。將14批樣品色譜數據導入《中藥指紋圖譜相似度評價系統》（2012版），采用中位數法，設定時間窗為0.10，經多點校正、全譜峰匹配后生成對照指紋圖譜（R），確定30個共有峰，結果見圖1。將樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜進行相似度評價，14批樣品指紋圖譜相似度均大于0.96，結果見表2。表明四神丸樣品整體較為相似，差異較小。

圖1 14批四神丸樣品指紋圖譜疊加圖

2.2.6 共有峰確認及歸屬

取“2.1.1”“2.1.3”項下溶液適量，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，見圖2。與對照品色譜圖和對照指紋圖譜比對，共確定10個共有特征峰。

表2 14批四神丸樣品指紋圖譜相似度評價結果（r）

編號相似度 編號相似度 編號相似度 S10.993 S60.992 S110.981 S20.994 S70.996 S120.987 S30.991 S80.989 S130.983 S40.992 S90.976 S140.969 S50.993 S100.967

注：1.補骨脂素；2.異補骨脂素；3.五味子醇甲；4.吳茱萸堿； 5.五味子醇乙；6.吳茱萸次堿；7.五味子酯甲；8.去氫二異丁香酚； 9.五味子甲素；10.五味子乙素

2.3 含量測定

2.3.1 線性關系考察

分別精密量取“2.1.1”項下對照品貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置25 mL量瓶中，制成系列濃度混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄各色譜峰峰面積。以各對照品濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和線性范圍，結果見表3。10種成分在相應范圍內線性關系良好。

表3 10種成分線性關系考察結果

成分回歸方程相關系數線性范圍/（μg/mL） 補骨脂素Y＝34.264X＋113.010.999 83.33～16.64 異補骨脂素Y＝31.526X＋119.8671.000 04.03～20.17 五味子甲素Y＝8.206X＋44.0980.999 54.29～21.46 五味子乙素Y＝49.56X＋159.070.999 94.18～20.88 五味子醇甲Y＝49.397X＋234.4120.999 05.08～25.41 五味子醇乙Y＝61.132X＋59.8470.999 53.74～18.72 五味子酯甲Y＝61.467X＋137.040.999 73.52～17.61 吳茱萸堿Y＝111.87X＋384.030.999 62.63～13.15 吳茱萸次堿Y＝41.686X＋81.8990.999 83.10～15.52 去氫二異丁香酚Y＝151.53X＋190.760.999 63.31～16.56

2.3.2 精密度試驗

精密量取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6次，結果各對照品峰面積RSD≤0.86%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗

取同一批四神丸樣品（S2）6份，按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，結果各對照品峰面積RSD≤1.12%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗

取同一批四神丸樣品（S2），按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，結果各對照品峰面積RSD≤1.20%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

取已知含量的四神丸樣品（S2）粉末約1.0 g，精密稱定6份，分別加入混合對照品溶液2 mL，按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，分別計算各成分的回收率。結果補骨脂素、異補骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫二異丁香酚的平均回收率分別為98.39%、100.01%、99.56%、92.08%、97.99%、97.62%、96.98%、99.05%、95.68%、98.61%，RSD分別為1.20%、1.81%、1.78%、2.75%、1.39%、1.54%、2.63%、1.96%、2.34%、1.05%，表明該方法回收率良好。

2.3.6 樣品含量測定

取四神丸樣品（S1～S14）粉末，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，計算樣品中補骨脂素、異補骨脂素、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫二異丁香酚的含量，結果見表4。

表4 14批四神丸樣品中10種成分含量測定結果（mg/g，n＝3）

編號補骨脂素異補骨脂素五味子甲素五味子乙素五味子醇甲五味子醇乙五味子酯甲吳茱萸堿吳茱萸次堿去氫二異丁香酚 S12.202.050.420.821.860.270.180.680.300.09 S22.172.070.390.811.830.250.180.680.300.09 S32.212.140.430.811.860.260.160.690.310.09 S42.232.200.410.781.880.260.170.690.320.09 S52.132.060.430.841.900.290.160.680.310.09 S62.202.060.400.801.830.260.180.660.300.09 S71.841.710.310.671.530.220.190.210.120.07 S81.601.660.240.631.500.170.150.200.100.05 S91.911.940.090.391.160.200.070.300.120.02 S102.032.060.480.601.230.150.090.260.110.11 S112.081.940.310.551.490.180.080.960.410.07 S122.121.980.330.571.410.180.100.980.410.07 S131.461.440.280.821.790.190.160.110.110.06 S141.671.590.220.651.200.130.260.540.200.05

2.4 化學計量學分析

2.4.1 聚類分析

將14批四神丸樣品指紋圖譜的共有峰峰面積導入SPSS20.0軟件，以峰面積為變量，采用最遠鄰元素法，以平方Euclidean距離為度量標準進行聚類分析，結果見圖3。當距離為10時，14批樣品可分為四類：S1～S8、S13為第一類，S9、S10為第二類，S11、S12為第三類，S14為第四類。表明同一廠家的樣品基本可聚為一類，不同廠家樣品間差異較大。

圖3 14批四神丸樣品聚類分析樹狀圖

2.4.2 主成分分析

為進一步區分和評價四神丸樣品，以所測得的10種成分含量為變量，導入SPSS20.0軟件進行主成分分析，結果見表5、表6。以特征值和方差貢獻率為依據，可提取3個主成分，其累積貢獻率達83.759%，表明3個主成分包含指紋圖譜的主要信息。由載荷絕對值可知，補骨脂素、吳茱萸堿和吳茱萸次堿對第1主成分的載荷值較大，五味子酯甲和五味子乙素對第2主成分的載荷值較大，去氫二異丁香酚對第3主成分的載荷值較大，表明四神丸質量的差異性是多個成分共同影響的結果。運用SIMCA-P11.5軟件進行分析，結果見圖4。14批樣品中，S1～S8、S13為一類，S9、S10為一類，S11、S12為一類，其余為一類，與聚類分析結果一致。

表5 四神丸樣品中10種成分含量主成分分析特征值和方差貢獻率

成分初始特征值 提取平方和載入 合計方差/%累積/% 合計方差/%累積/% 14.18141.81441.814 4.18141.81441.814 22.70026.99868.812 2.70026.99868.812 31.49514.94783.759 1.49514.94783.759 40.717 7.17190.930 50.659 6.58897.518 60.160 1.60199.119 70.056 0.55699.675 80.020 0.19799.872 90.012 0.11999.991 100.001 0.009100.000

表6 四神丸樣品中10種成分主成分載荷矩陣

成分成分1成分2成分3 補骨脂素0.803-0.489-0.046 異補骨脂素0.696-0.550-0.026 五味子醇甲0.6700.670-0.120 吳茱萸堿0.770-0.538-0.059 五味子醇乙0.5320.444-0.651 吳茱萸次堿0.791-0.429-0.146 五味子酯甲0.5320.7060.298 去氫二異丁香酚0.232-0.2160.912 五味子甲素0.5980.1290.133 五味子乙素0.6400.6900.302

圖4 14批四神丸樣品主成分分析

3 討論

四神丸化學成分復雜，為使其成分信息能夠最大程度被譜圖表征出來，本試驗供試品溶液制備方法比較了加熱回流提取法、超聲波提取法、索氏提取法，提取溶媒比較了甲醇、水和不同比例甲醇水溶液，綜合提取效率、結果穩定性等因素，確定提取條件為甲醇50 mL超聲提取30 min。

本試驗先采用二極管陣列檢測器進行190～400 nm全波長掃描，結果在230 nm波長處譜圖信息最為全面，基線較平穩。隨后比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液等流動相的洗脫效果，通過對流動相比例和時間的調整，最終確定“2.2.1”項下色譜條件最佳。

中藥制劑成分復雜，僅對某些成分進行含量測定無法全面反映其內在質量。四神丸以補骨脂補命門之火為君，以肉豆蔻溫中澀腸、五味子酸斂固澀、吳茱萸辛熱補火燥濕為臣，佐以生姜溫胃散寒、大棗益氣補中。在劉昌孝院士等[6]提出的中藥質量標志物基礎上，查閱文獻發現，補骨脂具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎及神經保護等作用，補骨脂素和異補骨脂素有抗骨質疏松、神經保護、抗腫瘤、抗炎等藥理作用，且具有肝臟毒性，為指標成分[7]；肉豆蔻具有止瀉、抗炎等多種功效，去氫二異丁香酚是主要活性成分[8-9]；五味子木質素類成分具有抗炎、抗心肌缺血、抗氧化、肝保護等作用，聯苯環辛二烯類木脂素類成分五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素為五味子的質量標志物[10]，五味子甲素、五味子酯甲可作為鑒別南、北五味子的標志物[11]。吳茱萸中生物堿是其主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、胃黏膜損傷保護作用，吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素為指標成分[12]。

本試驗采用HPLC對14批四神丸樣品進行分析，建立了指紋圖譜，并測定了補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子酯甲、吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫二異丁香酚10種成分的含量，聚類分析和主成分分析結果基本一致，建立的指紋圖譜和含量測定方法準確，可為四神丸質量標準的提升和完善提供參考。

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Study on Quality Control of Multi-components inPills Based on Fingerprints

WEI Wei1, HOU Jianzhong1, ZHU Shunjuan1, SHENG Xueyan2, GUO Huarong1

To establish the HPLC fingerprints and multi-component content determination method ofPills; To evaluate its quality by cluster analysis and principal component analysis.Totally 14 batches ofPills from different manufacturers were analyzed by InertSustain C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with methanol-0.1% phosphoric acid acqueous solution as mobile phase, gradient elution. Detection wavelength was 230 nm; flow rate was 1.0 mL/min; column temperature was 35 ℃. Chinese Medicine Choromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (2012 edition) was used to calculate similarity and determine common peaks. SPSS 20.0 and SIMCA-P 11.5 software were used for cluster analysis and principal component analysis, quality differences between samples were evaluated. The contents of 10 components were determined.The HPLC fingerprints ofPills were established. There were 30 common peaks, and 10 peaks were identified. The similarity between the samples and the control fingerprint was 0.967–0.996. The contents of psoralen, isopsoralen, schisandrin, schisandrol B, deoxyschizandrin, γ-schisandrin, schisantherin A, evodiamine, rutaecarpine, and dehydrodiisoeugenol were determined and the methodological investigation results met the requirements. 14 batches ofPills could be divided into four groups by cluster analysis and principal component analysis. The results showed that the samples from the same manufacturer could be basically divided into one category, and the differences among the samples from different manufacturers were relatively large.The fingerprints ofPills is specific, accurate and reliable, which can be used for the identification and overall quality control ofPills, and can provide the basis for the revision of the quality standard.

Pills; fingerprints; HPLC; cluster analysis; principal component analysis; quality control

R284.1

A

1005-5304(2021)10-0105-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202104215

甘肅省藥品科研項目（2020GSMPA021）

郭華榮，E-mail：1542118804@qq.com

（收稿日期：2021-04-12）

（修回日期：2021-05-06；編輯：陳靜）